張蔚　江曙等

摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便，稱重稀釋后厭氧培養(yǎng)，通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS）與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物，共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物，分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物；此外，篩選出了對阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌，其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46； 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA（16S rRNA）技術(shù)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

關(guān)鍵詞 阿魏酸； 腸道細(xì)菌； 超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

1 引 言

人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息，其中99%為厭氧菌，這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”，共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1，2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶，主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]?？诜幬镞M(jìn)入腸道后，不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物，因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動中起著重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實驗表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5，6 ]，已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前，已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報道 [7，8 ]，但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便， 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng)， 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS） 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物， 并用16S核糖體RNA技術(shù) （16S rRNA）對具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定， 鑒定出了對阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌，為全面了解腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UPLC AcquityTM系統(tǒng) （Waters公司）；SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 （Waters公司），配有電噴霧離子源 （ESI）；Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析軟件（Waters公司）；MLS3750型高壓蒸汽滅菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；WD9402A型PCR擴增儀（北京六一儀器公司）；DYY8C電泳儀（北京六一儀器公司）；TGL16B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；TD2102電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；EPED型超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）。

阿魏酸（中國藥品生物制品檢定所，批號 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液）、dNTPs（4種脫氧核糖核酸）、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒（上海博亞生物技術(shù)有限公司）；乙腈與甲酸為色譜純，其余試劑為分析純。

準(zhǔn)確稱取阿魏酸對照品適量，用超純水超聲溶解，配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液， 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 普通厭氧培養(yǎng)液（GAM）的配制、滅菌

稱取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸鹽0.30 g，硫代乙醇酸鈉0.30 g，用超純水加熱溶解，調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl，用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻備用 [11 ]。

2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

收集健康女性志愿者（受試者無腸道疾病或代謝性疾病史，且在采樣前3個月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素）的新鮮糞便5.0 g，與生理鹽水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，渦旋2 min制成混懸液，再1000 r/min離心10 min得上清液，即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋，吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上， 均勻涂布，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布，分離出69種細(xì)菌，標(biāo)號為sp.1～sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。

摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便，稱重稀釋后厭氧培養(yǎng)，通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS）與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物，共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物，分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物；此外，篩選出了對阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌，其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46； 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA（16S rRNA）技術(shù)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

關(guān)鍵詞 阿魏酸； 腸道細(xì)菌； 超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

1 引 言

人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息，其中99%為厭氧菌，這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”，共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1，2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶，主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]。口服藥物進(jìn)入腸道后，不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物，因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動中起著重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實驗表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5，6 ]，已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前，已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報道 [7，8 ]，但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便， 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng)， 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS） 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物， 并用16S核糖體RNA技術(shù) （16S rRNA）對具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定， 鑒定出了對阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌，為全面了解腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UPLC AcquityTM系統(tǒng) （Waters公司）；SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 （Waters公司），配有電噴霧離子源 （ESI）；Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析軟件（Waters公司）；MLS3750型高壓蒸汽滅菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；WD9402A型PCR擴增儀（北京六一儀器公司）；DYY8C電泳儀（北京六一儀器公司）；TGL16B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；TD2102電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；EPED型超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）。

阿魏酸（中國藥品生物制品檢定所，批號 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液）、dNTPs（4種脫氧核糖核酸）、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒（上海博亞生物技術(shù)有限公司）；乙腈與甲酸為色譜純，其余試劑為分析純。

準(zhǔn)確稱取阿魏酸對照品適量，用超純水超聲溶解，配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液， 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 普通厭氧培養(yǎng)液（GAM）的配制、滅菌

稱取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸鹽0.30 g，硫代乙醇酸鈉0.30 g，用超純水加熱溶解，調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl，用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻備用 [11 ]。

2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

收集健康女性志愿者（受試者無腸道疾病或代謝性疾病史，且在采樣前3個月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素）的新鮮糞便5.0 g，與生理鹽水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，渦旋2 min制成混懸液，再1000 r/min離心10 min得上清液，即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋，吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上， 均勻涂布，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布，分離出69種細(xì)菌，標(biāo)號為sp.1～sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。

摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便，稱重稀釋后厭氧培養(yǎng)，通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS）與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物，共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物，分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物；此外，篩選出了對阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌，其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46； 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA（16S rRNA）技術(shù)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

關(guān)鍵詞 阿魏酸； 腸道細(xì)菌； 超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

1 引 言

人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息，其中99%為厭氧菌，這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”，共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1，2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶，主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]?？诜幬镞M(jìn)入腸道后，不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物，因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動中起著重要作用 [4 ]。

阿魏酸（Ferulic acid），化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實驗表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5，6 ]，已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前，已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報道 [7，8 ]，但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便， 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng)， 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCQTOF/MS） 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物， 并用16S核糖體RNA技術(shù) （16S rRNA）對具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定， 鑒定出了對阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌，為全面了解腸道細(xì)菌對阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UPLC AcquityTM系統(tǒng) （Waters公司）；SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 （Waters公司），配有電噴霧離子源 （ESI）；Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 （Waters公司）；MetaboLynxTM分析軟件（Waters公司）；MLS3750型高壓蒸汽滅菌器（SANYO公司）；GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；WD9402A型PCR擴增儀（北京六一儀器公司）；DYY8C電泳儀（北京六一儀器公司）；TGL16B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；TD2102電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；EPED型超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）。

阿魏酸（中國藥品生物制品檢定所，批號 110773201012）；PfuX7（DNA聚合酶）、Pfu buffer（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液）、dNTPs（4種脫氧核糖核酸）、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒（上海博亞生物技術(shù)有限公司）；乙腈與甲酸為色譜純，其余試劑為分析純。

準(zhǔn)確稱取阿魏酸對照品適量，用超純水超聲溶解，配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液， 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 普通厭氧培養(yǎng)液（GAM）的配制、滅菌

稱取胰蛋白胨10.00 g，大豆蛋白胨3.00 g，朊胨10.00 g，酵母浸膏5.00 g，血清消化粉13.50 g，牛肝浸出粉1.20 g，牛肉膏2.20 g，葡萄糖3.00 g，KH2PO4 2.50 g，NaCl 3.00 g，可溶性淀粉5.00 g，L半胱氨酸鹽0.30 g，硫代乙醇酸鈉0.30 g，用超純水加熱溶解，調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl，用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻備用 [11 ]。

2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

收集健康女性志愿者（受試者無腸道疾病或代謝性疾病史，且在采樣前3個月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素）的新鮮糞便5.0 g，與生理鹽水按比例1 ∶ 4 （g/mL）比例混合，渦旋2 min制成混懸液，再1000 r/min離心10 min得上清液，即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋，吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上， 均勻涂布，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布，分離出69種細(xì)菌，標(biāo)號為sp.1～sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中，以便后面研究使用 [13 ]。