胡艷云 徐慧群等
摘 要 以三唑酮為模板分子,三氟甲基丙烯酸為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,合成了對(duì)三唑類農(nóng)藥具有高選擇性的分子印跡聚合物。將印跡聚合物作為固相萃取填料,優(yōu)化分離、富集三唑類農(nóng)藥的最優(yōu)上樣、淋洗和洗脫條件。結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,實(shí)現(xiàn)了果蔬樣品中20種三唑類殺菌劑的高通量特異性檢測(cè)。對(duì)樣品前處理過程中的加標(biāo)回收率進(jìn)行了考察,并對(duì)比了分子印跡固相萃取和ENVICarb/SPE小柱的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明:在1.0, 2.0 和10.0 μg/kg加標(biāo)水平下,三唑類農(nóng)藥的回收率在 81.0%~109.7% 之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.6%,基質(zhì)效應(yīng)在 91.1%~121.8%之間。方法靈敏、準(zhǔn)確度高,與ENVICarb/SPE 小柱相比,能更有效減弱基體效應(yīng)。
關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物; 固相萃?。?三唑類農(nóng)藥
1 引 言
三唑類殺菌劑是指含有1,2,4三唑環(huán)的化合物,由于具有低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、稻谷等病蟲害的防治 [1~3 ]。隨著三唑類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,其在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的殘留問題,也逐漸引起人們的重視。對(duì)其在食品和環(huán)境中的殘留分析需要從復(fù)雜的基質(zhì)樣品中將低濃度的目標(biāo)化合物高效提取和凈化,因此對(duì)樣品前處理提出較高要求。而傳統(tǒng)上廣泛使用的固相萃取技術(shù)特異性不強(qiáng),常發(fā)生雜質(zhì)共萃取現(xiàn)象 [4,5 ]。因此亟待開發(fā)一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)技術(shù)。
分子印跡聚合物(MIPs)能夠選擇性提取復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分子或與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)相似的化合物, 適合作為固相萃取的材料 [6~8 ]。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比,分子印跡固相萃?。∕ISPE)克服了試樣體系復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等不利因素,提高了分析準(zhǔn)確性,更適用于痕量分析 [9~12 ]。三唑類化合物的MISPE方法已有少量文獻(xiàn)報(bào)道,彭暢等 [13 ]采用鄰硝基苯酚為替代模板,4乙烯基吡啶為功能單體,合成了對(duì)7種三唑類化合物具有特異性吸附的印跡聚合物,并應(yīng)用于土壤樣品的分析中。
本研究以三唑酮為模板分子,三氟甲基丙烯酸為功能單體,合成了對(duì)20種三唑類農(nóng)藥具有高選擇性的MIP材料。MISPE結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,實(shí)現(xiàn)了果蔬樣品中三唑類殺菌劑殘留的特異性分離富集和檢測(cè),方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高,與現(xiàn)有SPE技術(shù)相比,有效降低了樣品基質(zhì)效應(yīng)。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 試劑與儀器
Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司),API 4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);E811全自動(dòng)索氏提取儀(瑞士Buchi公司)。
三唑酮等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(Dr. Ehrenstorfer公司);三氟甲基丙烯酸(Trifluoromethyl acrylic acid, TFMAA),乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethyleneglycol dimethacrylate, Egdma),均為分析純(SigmaAldrich公司),使用前純化;偶氮二異丁腈 (Azobisisbutyronitrile, AIBN,化學(xué)純,上海試劑四廠);乙酸(分析純,國藥集團(tuán));乙腈、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、甲苯(色譜純, 美國Tedia公司)。石墨化碳黑SPE柱(ENVICarb/PSA PE,0.5 g, 6 mL,美國SigmaAldrich公司)。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別稱取三唑酮等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.5%)各10~20 mg, 溶于乙腈并定容至 100 mL,配制成100~200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以單標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋配制而成,濃度為1.0 mg/L, 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 0.01, 0.005和0.001 mg/L)由混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用乙腈逐級(jí)稀釋而成。
2.3 實(shí)驗(yàn)方法
色譜柱為Waters C18柱(100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;流速:200 μL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:乙腈(A),10 mmol/L乙酸銨溶液(B);梯度:0~5 min,10%~30% A;5~15 min,30%~50% A;15~25 min,50%~95% A;25~25.1 min,95%~10% A;25.1~35 min,10% A。
電噴霧電壓:5500 V;霧化氣壓力: 4.14 MPa;氣簾氣壓力:1.38 MPa;輔助氣流速:4.14×103; 離子源溫度:450 ℃;正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè);碰撞氣:Medium;,定性離子對(duì)和定量離子對(duì)的去簇電壓(Declustering potential,DP)、碰撞能量(Collision energy,CE)見表1。
2.4 印跡聚合物制備
將1 mmol三唑酮溶于60 mL三氯甲烷甲苯(2 ∶ 1, V/V)中, 加入4 mmol TFMAA,超聲1 h,使三唑酮與TFMAA充分作用;加入20 mmol EGDMA和60 mg AIBN,超聲0.5 h,充分混溶后,通N2脫氧30 min,真空狀態(tài)下密封;將其放入60 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)24 h,取出,干燥,研磨過篩, 以甲醇乙酸(9 ∶ 1, V/V)為提取劑,索氏提取24 h; 用甲醇洗至中性,在25 ℃下真空干燥過夜,得到印跡聚合物MIPs。非印跡聚合物(Nonimprinted polymers,NIPs)的合成除不加分子模板三唑酮外,其余步驟同上。
2.5 三唑酮分子印跡的平衡吸附實(shí)驗(yàn)
取MIPs以及NIPs各50 mg放入具塞試管中,分別加入10 mL不同濃度(0~2.6 mmol/L)的三唑酮溶液,渦旋10 min。計(jì)算其吸附量Q,由Q作結(jié)合等溫線圖,并進(jìn)行Scatchard分析。
聚合物吸附率的計(jì)算公式:Q=(C0-Ct)V/m, 單位(μmol/g), 其中C0為三唑酮的原始濃度, Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度, V為三唑酮溶液的體積, m為聚合物的質(zhì)量。
2.6 樣品的預(yù)處理
稱取5.0 g(準(zhǔn)確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi),加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷(12 ∶ 1, V/V)渦旋混勻提取2 min ,以3000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液,重復(fù)上述操作,合并提取液,在40 ℃以下,濃縮至近干,用2 mL乙腈清洗,用水定容至10 mL,待凈化。
2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)
2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中,加入篩板,壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液,取10 mL溶液過柱,采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫,收集洗脫液,吹干后溶解于10 mL乙腈中,用LCMS/MS測(cè)定??疾觳煌纳蠘?、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。
2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE:依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈(V/V)淋洗活化MISPE柱,將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液,以不超過1.0 mL/min的流速過柱, 用2 mL 20%乙腈洗滌,最后用5 mL乙腈洗脫。
ENVICarb/PSA SPE:柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉,用2 mL乙腈甲苯(3 ∶ 1,V/V)活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后,用6 mL 乙腈甲苯(3 ∶ 1, V/V)分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中,收集流出液。
2.8 基質(zhì)效應(yīng)
空白樣品按照上述前處理方法處理后,在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品,通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。
3 結(jié)果與討論
3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響
致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu),且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度,在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14,15 ]。在非共價(jià)印跡體系中,致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性,且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響,選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物,用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見,以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻;以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密,模板分子不易被洗脫,會(huì)造成模板泄露問題,且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí),研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn),聚合物的硬度明顯變軟,呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu),這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積,同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題,從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。
[TS(][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖
Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer (MIPs) prepared by different porogens
A. 乙腈 (Acetonitrile); B. 三氯甲烷(Chloroform); C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑(Chloroformtoluene mixtures)。 [HT5][TS)]
3.2 吸附性能研究
通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性,吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加,MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量,這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn),主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用,無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),渦旋10 min后,三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。
聚合物吸附率的計(jì)算公式:Q=(C0-Ct)V/m, 單位(μmol/g), 其中C0為三唑酮的原始濃度, Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度, V為三唑酮溶液的體積, m為聚合物的質(zhì)量。
2.6 樣品的預(yù)處理
稱取5.0 g(準(zhǔn)確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi),加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷(12 ∶ 1, V/V)渦旋混勻提取2 min ,以3000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液,重復(fù)上述操作,合并提取液,在40 ℃以下,濃縮至近干,用2 mL乙腈清洗,用水定容至10 mL,待凈化。
2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)
2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中,加入篩板,壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液,取10 mL溶液過柱,采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫,收集洗脫液,吹干后溶解于10 mL乙腈中,用LCMS/MS測(cè)定??疾觳煌纳蠘?、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。
2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE:依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈(V/V)淋洗活化MISPE柱,將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液,以不超過1.0 mL/min的流速過柱, 用2 mL 20%乙腈洗滌,最后用5 mL乙腈洗脫。
ENVICarb/PSA SPE:柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉,用2 mL乙腈甲苯(3 ∶ 1,V/V)活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后,用6 mL 乙腈甲苯(3 ∶ 1, V/V)分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中,收集流出液。
2.8 基質(zhì)效應(yīng)
空白樣品按照上述前處理方法處理后,在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品,通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。
3 結(jié)果與討論
3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響
致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu),且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度,在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14,15 ]。在非共價(jià)印跡體系中,致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性,且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響,選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物,用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見,以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻;以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密,模板分子不易被洗脫,會(huì)造成模板泄露問題,且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí),研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn),聚合物的硬度明顯變軟,呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu),這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積,同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題,從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。
[TS(][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖
Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer (MIPs) prepared by different porogens
A. 乙腈 (Acetonitrile); B. 三氯甲烷(Chloroform); C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑(Chloroformtoluene mixtures)。 [HT5][TS)]
3.2 吸附性能研究
通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性,吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加,MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量,這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn),主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用,無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),渦旋10 min后,三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。
聚合物吸附率的計(jì)算公式:Q=(C0-Ct)V/m, 單位(μmol/g), 其中C0為三唑酮的原始濃度, Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度, V為三唑酮溶液的體積, m為聚合物的質(zhì)量。
2.6 樣品的預(yù)處理
稱取5.0 g(準(zhǔn)確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi),加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷(12 ∶ 1, V/V)渦旋混勻提取2 min ,以3000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液,重復(fù)上述操作,合并提取液,在40 ℃以下,濃縮至近干,用2 mL乙腈清洗,用水定容至10 mL,待凈化。
2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)
2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中,加入篩板,壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液,取10 mL溶液過柱,采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫,收集洗脫液,吹干后溶解于10 mL乙腈中,用LCMS/MS測(cè)定??疾觳煌纳蠘?、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。
2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE:依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈(V/V)淋洗活化MISPE柱,將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液,以不超過1.0 mL/min的流速過柱, 用2 mL 20%乙腈洗滌,最后用5 mL乙腈洗脫。
ENVICarb/PSA SPE:柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉,用2 mL乙腈甲苯(3 ∶ 1,V/V)活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后,用6 mL 乙腈甲苯(3 ∶ 1, V/V)分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中,收集流出液。
2.8 基質(zhì)效應(yīng)
空白樣品按照上述前處理方法處理后,在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品,通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。
3 結(jié)果與討論
3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響
致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu),且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度,在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14,15 ]。在非共價(jià)印跡體系中,致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性,且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響,選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物,用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見,以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻;以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密,模板分子不易被洗脫,會(huì)造成模板泄露問題,且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí),研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn),聚合物的硬度明顯變軟,呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu),這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積,同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題,從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。
[TS(][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖
Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer (MIPs) prepared by different porogens
A. 乙腈 (Acetonitrile); B. 三氯甲烷(Chloroform); C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑(Chloroformtoluene mixtures)。 [HT5][TS)]
3.2 吸附性能研究
通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性,吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加,MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量,這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn),主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用,無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),渦旋10 min后,三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。