周懷彬，王金丹，胡理懷，溫超瑋，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9基因多態(tài)性分析

周懷彬，王金丹，胡理懷，溫超瑋，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

目的：研究溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19、CYP2C9基因多態(tài)性分布。方法：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和測(cè)序方法，對(duì)287例健康人群CYP2C19、CYP2C9基因多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果：溫州地區(qū)漢族人群的CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3三種等位基因的頻率分別為65.16%、29.27%和5.57%；CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3基因型的頻率分別為44.95%、33.45%、6.97%、4.18%、10.45%和0.00%，弱代謝率為14.63%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因頻率分別為97.74%和2.26%，CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3的基因頻率為95.47%和4.53%，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3/*3。結(jié)論：溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9弱代謝率與已報(bào)道的漢族人群基本一致，與日本人群相近，顯著高于歐美人群。

P450；CYP2C19；CYP2C9；多態(tài)性；溫州地區(qū)；漢族

細(xì)胞色素（cytochrome P450，CYP450）是一組參與生物轉(zhuǎn)化的超基因家族編碼的同工酶。其中CYP2C是細(xì)胞色素P450的主要成分，占其總量的20%。在CYP2C的亞家族中，CYP2C19和CYP2C9藥物反應(yīng)起著關(guān)鍵的作用。CYP2C19主要參與代謝的藥物有：質(zhì)子泵抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗精神病藥、降糖藥、抗凝藥、抗瘧疾藥以及一些抗癌藥物等。CYP2C9主要參與代謝的藥物有香豆素類抗凝血藥、血管緊張素II受體拮抗劑、口服降血糖藥、抗癲癇藥等。這兩個(gè)基因酶活性在人群中呈多態(tài)性分布，而基因的多態(tài)性是導(dǎo)致這些酶活性個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。我們利用測(cè)序方法對(duì)287例溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9最主要的幾個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，計(jì)算各等位基因和代謝型的頻率，為該地區(qū)的遺傳多態(tài)性研究和臨床合理用藥提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取287例溫州地區(qū)漢族健康體檢人群，抽取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20 ℃保存待檢。所有血樣的采集均依據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)管理規(guī)定執(zhí)行。

1.2 DNA提取 用寶生物工程（大連）有限公司Universal Genomic DNA Extraction Kit，按使用說(shuō)明書進(jìn)行操作提取DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 查閱文獻(xiàn)，根據(jù)NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列，用Primer3在線設(shè)計(jì)引物（序列見表1）。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 CYP2C19和CYP2C9引物序列

1.4 PCR擴(kuò)增 50μL PCR體系包含100 ng基因組DNA，3μL 25 mmol/L MgCl2，5μL 2.5 mmol/L dNTP，5μL 10×buffer，20μmol/L引物各0.2μL，1 U Taq，用ddH2O補(bǔ)足50μL。95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，53～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，4 ℃保溫。

1.5 DNA測(cè)序分型 對(duì)PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，送上海鼎安生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序引物序列見表1）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)基因型頻率計(jì)算等位基因頻率，采用x2檢驗(yàn)分析基因型頻率與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，比較本組結(jié)果與其他文獻(xiàn)公布的不同種族人群之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定 CYP2C19*2和CYP2C19*3分別是681位點(diǎn)和636位點(diǎn)發(fā)生G→A突變。根據(jù)這兩個(gè)位點(diǎn)的突變情況的不同組合呈現(xiàn)不同的基因型。兩個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生突變，基因型為CYP2C19*1/*1；636位點(diǎn)未突變，681位點(diǎn)雜合突變和純合突變，對(duì)應(yīng)基因型分別為CYP2C19*1/*2和CYP2C19*2/*2；681位點(diǎn)未突變，636位點(diǎn)雜合和純合突變，對(duì)應(yīng)基因型分別是CYP2C19*1/*3和CYP2C19*3/*3；兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生突變對(duì)應(yīng)基因型為CYP2C19*2/*3（見表2和圖1）。

表2 CYP2C19和CYP2C9突變位點(diǎn)和基因型

CYP2C9*3是1075位點(diǎn)發(fā)生A→C突變。根據(jù)這個(gè)位點(diǎn)的突變情況分三種基因型：未發(fā)生突變的基因型為CYP2C9*1/*1，發(fā)生雜合突變的為CYP2C9*1/*3，發(fā)生純合突變的為CYP2C9*3/*3（見表2和圖1）。

2.2 CYP2C19和CYP2C9等位基因頻率分布 在287例溫州地區(qū)漢族人群中，CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因頻率分別為65.16%、29.27%、5.57%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因頻率分別為97.74%和2.26%（見表3）。經(jīng)x2檢驗(yàn)，P＞0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對(duì)象來(lái)自同一個(gè)群體，具有較好的代表性。

2.3 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型頻率分布 結(jié)果（見表4）表明，在287例標(biāo)本中，CYP2C19基因型以CYP2C19*1/*1居多，CYP2C19*1/*2次之，未發(fā)現(xiàn)CYP2C19*3/*3型；CYP2C9各基因型中，以野生型CYP2C9*1/*1為主，共274例（占95.47%），CYP2C9*1/ *3有13例，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3/*3型?；虮硇椭校珻YP2C19弱代謝型有三種基因型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3），本研究287例標(biāo)本中CYP2C19弱代謝型的有42例，占14.63%；CYP2C9弱代謝型有兩種基因型（CYP2C9*3/*3和CYP2C9*1/ *3），287例標(biāo)本中CYP2C9弱代謝型有13例，占4.53%。

圖1 CYP2C19和CYP2C9代表性測(cè)序峰圖

表3 CYP2C19和CYP2C9等位基因頻率分布

3 討論

在中國(guó)人群中CYP2C19基因突變的主要類型是CYP2C19*2和CYP2C19*3[1]。CYP2C19*2是在第5外顯子681堿基處發(fā)生單堿基突變（G→A），產(chǎn)生一個(gè)異常拼接位點(diǎn)，造成mRNA的閱讀框架改變；CYP2C19*3發(fā)生在第4外顯子的636堿基處（G→A），結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)過(guò)早的終止子，導(dǎo)致編碼蛋白合成縮短。這兩個(gè)位點(diǎn)的突變都可引起代謝酶活性下降或缺失。野生純合子為強(qiáng)代謝型（CYP2C19*1/*1），只有其中一個(gè)位點(diǎn)突變的為中間代謝型（CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3），其中一個(gè)位點(diǎn)純合突變或兩個(gè)點(diǎn)雜合突變?yōu)槿醮x型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3）。CYP2C9在人類中存在多種突變體，其中在東亞人中最常見的突變是CYP2C9*3[2]。該位點(diǎn)突變會(huì)引起359位氨基酸變化（Ile359Leu，1075A＞C），破壞了蛋白底物識(shí)別位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)一個(gè)β折疊，從而影響蛋白功能。攜帶突變型基因的個(gè)體代謝相應(yīng)藥物能力較攜帶野生型基因個(gè)體為低，通常較易發(fā)生不良反應(yīng)。比如CYP2C9參與代謝的抗凝血藥華法林在臨床中有廣泛的應(yīng)用，能較好地預(yù)防血液透析長(zhǎng)期深靜脈導(dǎo)管血栓形成，但出血風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大[3]，所以國(guó)內(nèi)外專家[4-5]建議該類藥物根據(jù)基因型來(lái)確定藥物的劑量。

表4 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型頻率分布

本研究發(fā)現(xiàn)，溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，等位基因*1、*2、*3，分別為65.16%、29.27%和5.57%。其中CYP2C19*2遠(yuǎn)大于CYP2C19*3，未檢測(cè)到CYP2C19*3/*3，說(shuō)明CYP2C19*2是溫州地區(qū)漢族人群弱代謝的主要原因。CYP2C19各基因表型中，弱代謝型占14.63%，跟已報(bào)道[5-6]的國(guó)內(nèi)漢族人群基本相符，遠(yuǎn)高于白種人的3%～5%，跟日本人群的18.86%[7]相近。本研究中CYP2C9*3等位基因頻率為2.26%，跟已報(bào)道的漢族人群（為2.94%）沒有顯著性差異，跟南方漢族人群基本一致（為2.44%）[8]，顯著低于羅馬尼亞人群的9.3%[9]和西班牙人群中的16.2%[10]，與日本的2.06%相近[11]。說(shuō)明CYP2C19和CYP2C9具有種族差異。中國(guó)幅員遼闊，各地區(qū)既有相同的遺傳背景又有各自的特點(diǎn)，了解本地區(qū)的藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性分布情況，對(duì)臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義。本研究隨機(jī)抽取溫州地區(qū)287例漢族健康體檢人員進(jìn)行CYP2C19和CYP2C9常見多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的代表性，希望能為本地區(qū)的遺傳多態(tài)性分析和個(gè)體化用藥提供參考。

[1] de Morais SM, Wilkinson GR, Blaisdell J, et al. The major genetic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin metabolism in humans[J]. J Biol Chem, 1994, 269(22): 15419-15422.

[2] Bae JW, Kim HK, Kim JH, et al. Allele and genotype frequencies of CYP2C9 in a Korean population[J]. Br J Clin Pharmacol, 2005, 60(4): 418-422.

[3] 蔡曉青, 周瑩, 黃麗丹, 等. 華法林和拜阿司匹林預(yù)防血液透析長(zhǎng)期深靜脈導(dǎo)管血栓形成的作用[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 43(12): 823-825.

[4] Miao L, Yang J, Huang C, et al. Contribution of age, body weight, and CYP2C9 and VKORC1 genotype to the anticoagulant response to warfarin: prlposal for a new dosing regimen in Chinese patients[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2007, 63(12): 1135-1141.

[5] 夏東亞, 左金梁, 趙東祥, 等. 中國(guó)漢族和蒙古族健康人藥物代謝酶CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6基因多態(tài)性分析[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2012, 47(24): 2017-2022.

[6] 顧連云, 趙萍. CYP2C19基因多態(tài)性在江蘇及其周邊地區(qū)漢族人群的調(diào)查研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2011, 15 (1): 125-128.

[7] Kubota T, Chiba K, Ishizaki T. Genotyping of S-mephenytoin 4’-hydroxylation in an extend Japanese population[J]. Clin Pharmacol Ther, 1996, 60(6): 661-666.

[8] Dai DP, Xu RA, Hu LM, et al. CYP2C9 polymorphism analysis in Han Chinese populations: building the largest allele frequency database[J]. Pharmacogenomics J, 2014, 14(1): 85-92.

[9] Buzoianu AD, Trifa AP, Muresanu DF, et al. Analysis of CYP2C9*2, CYP2C9*3 and VKORC1-1639 G＞A polymorphisms in a population from South-Eastern Europe[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(12): 2919-2924.

[10] Garcia-Martin E, Martinez C, Ladero JM, et al. High frequency of mutations related to impaired CYP2C9 metabolism in a Caucasian population[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2001, 57(1): 47-49.

[11] Nasu K, Kubota T, Ishizaki T. Genetic analysis of CYP2C9 polymorphism in a Japanese population[J]. Pharmacogenetics, 1997, 7(5): 405-409.

（本文編輯：吳健敏）

·論 著·

Objective:To investigate distribution status of CYP2C19 and CYP2C9 genotype in Wenzhou Han population.Methods:The CYP2C19 and CYP2C9 genotype of 287 Wenzhou Han Chinese were determined by sequencing.Results:In Wenzhou Han population, CYP2C19*1, CYP2C19*2 and CYP2C19*3 allele frequencies were 65.16%, 29.27% and 13.6%, respectively; CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3, CYP2C19*2/*3, CYP2C19*2/*2 and CYP2C19*3/*3 genotype frequencies were 44.95%, 33.45%, 6.97%, 4.18% and 0.00%, respectively. The frequency of CYP2C19 poor metabolisms was 14.63%; CYP2C9*1 and CYP2C9*3 allele frequencies were 97.74% and 2.26%, respectively; CYP2C9*1/*1 and CYP2C9*1/*3 genotype frequencies were 95.47% and 4.53%, respectively, CYP2C9*3/*3 homozygous genotype was not found in this study. Conclusion: The frequencie of CYP2C19 and CYP2C9 poor metabolisms are similar to those of Japanese population, whereas they are signifcantly different from America-European populations.

cytochrome P450; CPY2C19; CYP2C9; polymorphism; Wenzhou; Han population

Q39；R969.3

A

1000-2138（2014）12-0864-04

2014-05-05

國(guó)家青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81200253）；浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（2012R10048）。

周懷彬（1981-），男，浙江永嘉人，助理實(shí)驗(yàn)師，遺傳學(xué)碩士。

呂建新，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jxlu313@163. com。

Analysis of genetic polymorphism of CYP2C19 and CYP2C9 in Wenzhou Han population

ZHOU Huaibin, WANG Jindan, HU Lihuai, WEN Chaowei, LV Jianxin. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035