劉立，趙敏

與其他病毒比較，慢病毒具有轉(zhuǎn)染效率高、遺傳表達(dá)穩(wěn)定、能感染多種細(xì)胞等優(yōu)勢[1]，近年來開始用于眼科研究。眼球具有易于操作和觀察的特點(diǎn)，是眼科基因治療的優(yōu)勢之一。選擇最佳的給藥途徑以作用于靶向組織是當(dāng)前基因治療研究的熱點(diǎn)。有學(xué)者通過角膜基質(zhì)注射和刮除角膜上皮敷貼兩種途徑進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)注射效率更高，但該操作技術(shù)要求較高[2]，且對角膜有明顯的侵襲性，需要尋找其他更簡便高效的轉(zhuǎn)染途徑。慢病毒載體來源于人免疫缺陷病毒1型、2型(HIV-1、HIV-2)，貓免疫缺陷病毒(FIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，將反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞后移植，可導(dǎo)致X染色體連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID-X1)患者發(fā)生白血病，表明病毒載體的使用存在一定安全問題[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察并分析慢病毒載體介導(dǎo)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(LV-EGFP)轉(zhuǎn)染大鼠角膜的效率及其毒性，以篩選慢病毒轉(zhuǎn)染角膜的最佳途徑，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要器材 SPF級健康成年SD大鼠25只，體重160～180g，雌雄不限(重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，大鼠的相關(guān)處理符合美國眼科協(xié)會有關(guān)規(guī)定。慢病毒載體LV-EGFP(元件順序?yàn)閙U6-MCS-Ubi-EGFP，上海吉?jiǎng)P基因公司合成)。倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。RPMI 1640培養(yǎng)液及2%熱滅活的胎牛血清(FCS，Hyclone公司，美國)，硫酸鏈霉素及青霉素(華北制藥華勝有限公司)，L-谷氨酰胺(Invitrogen公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 原始病毒滴度測定為1.5×109TU/ml，使用Enhanced Infection Solution進(jìn)行稀釋，轉(zhuǎn)染前1h使用聚凝胺(濃度為10μg/ml)與慢病毒進(jìn)行等體積充分混合，并靜置于4℃冰箱。按照完全隨機(jī)分組法分組。感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)以大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞計(jì)算。A組：MOI=5點(diǎn)眼組；B組：MOI=5結(jié)膜下注射組；C組：MOI=10點(diǎn)眼組；D組：MOI=10結(jié)膜下注射組；E組：MOI=10離體轉(zhuǎn)染組。MOI=5和MOI=10分別對應(yīng)病毒量為3×105TU/角膜和6×105TU/角膜，稀釋后的體積分別為5μl及10μl。A、B組以及C、D組分別來自同一大鼠的左眼及右眼。A、B組共用10只大鼠，C、D組共用10只大鼠(在實(shí)驗(yàn)過程中A、B組大鼠和C、D組大鼠各死亡1只，實(shí)際統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分別為9只)，離體轉(zhuǎn)染組使用5只大鼠。

1.3 轉(zhuǎn)染模型的建立 活體轉(zhuǎn)染：所有大鼠均采用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射進(jìn)行全身麻醉，并聯(lián)合使用1%鹽酸奧布卡因進(jìn)行眼部局麻。轉(zhuǎn)染前1h使用聚凝膠(濃度為10μg/ml)與慢病毒進(jìn)行等體積充分混合，并靜置于4℃冰箱。待大鼠麻醉效果滿意后，結(jié)膜下注射組用微量注射器于右眼9點(diǎn)位角膜緣外約2mm結(jié)膜處進(jìn)針，緩慢注射，注射完畢后以棉簽輕按注射處，迅速退出針頭，以防止病毒液在針頭退出時(shí)被帶出。點(diǎn)眼組使用微量注射器將病毒液緩慢均勻滴注到大鼠角膜表面。因大鼠結(jié)膜囊容量有限，共分3次滴完，每次間隔2min。各組大鼠每日給予病毒1次，連續(xù)7d。

離體轉(zhuǎn)染：取出以水合氯醛過量麻醉處死的大鼠眼球，采用10%聚維酮碘持續(xù)沖洗2min，平衡液沖洗2次，洗凈聚維酮碘；沿距角膜緣周圍1～2mm，以角膜緣為同心圓將角膜及鞏膜一同剪下，將其置于96孔板內(nèi)。將LV-EGFP以6×105TU/角膜(即MOI=10)加入孔中，同時(shí)加入離體培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液、100U/ml青霉素、100mg/ml硫酸鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺和2%熱滅活FCS)2ml進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每次轉(zhuǎn)染時(shí)間6h，每24h更換離體培養(yǎng)液及病毒液，連續(xù)7d后取出角膜。

1.4 角膜熒光觀察 活體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染7d后于顯微鏡下完整取下雙眼角膜，離體轉(zhuǎn)染組直接從轉(zhuǎn)染液中取出，置于4%多聚甲醛中固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為6μm，置于烤箱烘干后在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度及分布情況并拍照。

1.5 HE染色及觀察 將已經(jīng)切片的角膜組織行常規(guī)HE染色，并于顯微鏡下觀察各組角膜細(xì)胞的形態(tài)，有無炎性細(xì)胞浸潤，有無凋亡細(xì)胞，以確定慢病毒對角膜細(xì)胞是否存在毒性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有圖片均在同一顯微鏡下觀察，拍攝參數(shù)均相同，且于同一天拍攝完成。熒光圖片采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行處理，將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為光密度(A)值，數(shù)據(jù)資料以x±s表示。相同MOI值組別之間比較采用配對t檢驗(yàn)，不同MOI組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下熒光分布情況 各組角膜全層出現(xiàn)明顯熒光表達(dá)，主要分布于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，較基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)。點(diǎn)眼方式轉(zhuǎn)染角膜熒光分布均勻，全層角膜出現(xiàn)較強(qiáng)熒光表達(dá)，角膜細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。結(jié)膜下注射方式轉(zhuǎn)染角膜全層均有熒光分布，但分布不均勻，主要成團(tuán)分布于角膜內(nèi)皮細(xì)胞附近。離體轉(zhuǎn)染全角膜呈強(qiáng)熒光表達(dá)，近內(nèi)皮細(xì)胞處可見少許成團(tuán)分布(圖1)。

2.2 角膜熒光強(qiáng)度比較 各組熒光強(qiáng)度分別為：A組0.1803±0.0440，B組0.1061±0.0434，C組0.2369±0.0157，D組0.2002±0.0307，E組0.2434±0.0173。相同MOI不同轉(zhuǎn)染途徑兩組比較(A組與B組、C組與D組比較)，點(diǎn)眼方式的熒光表達(dá)較結(jié)膜下注射方式更加強(qiáng)烈(P<0.05)。相同轉(zhuǎn)染方式的兩組相比(A組與C組、B組與D組比較)，高M(jìn)OI組熒光表達(dá)更強(qiáng)烈(P<0.05)。E組熒光強(qiáng)度與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 HE染色觀察 各組角膜結(jié)構(gòu)完整，各細(xì)胞層次清晰，層間未見炎性細(xì)胞分布，未見新生血管，細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯細(xì)胞凋亡。離體轉(zhuǎn)染角膜經(jīng)7d培養(yǎng)液轉(zhuǎn)染后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞仍然生長良好，未見內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、變形及缺失等病理改變(圖2)。

圖2 大鼠角膜病理分析(HE ×100)Fig.2Histopathologic image of rat cornea (HE ×100)

3 討 論

EGFP報(bào)告基因在反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移效率的評估。本實(shí)驗(yàn)首先建立了3種不同角膜轉(zhuǎn)染途徑的動(dòng)物模型，即點(diǎn)眼方式、結(jié)膜下注射方式和離體角膜轉(zhuǎn)染方式。這3種轉(zhuǎn)染方法簡便易行，其中點(diǎn)眼和結(jié)膜下注射為眼科最常用的給藥方式，便于實(shí)施。分析角膜熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，在相同MOI條件下，點(diǎn)眼方式的角膜熒光強(qiáng)度高于結(jié)膜下注射方式(P<0.05)，且熒光在角膜的分布更為均勻。結(jié)膜下注射角膜熒光強(qiáng)弱不均，較強(qiáng)熒光主要出現(xiàn)在角膜內(nèi)皮層附近。導(dǎo)致點(diǎn)眼方式轉(zhuǎn)染效率較高的原因可能與點(diǎn)眼后藥物主要分布于眼前節(jié)組織如結(jié)膜、角膜、房水等有關(guān)，結(jié)膜下注射除上述組織獲得高度藥物濃度外，晶體和玻璃體內(nèi)亦存在一定量藥物，其分布范圍廣于點(diǎn)眼方式。因此，在相同MOI條件下，通過結(jié)膜下注射方式進(jìn)入角膜的病毒數(shù)量少于點(diǎn)眼方式。

離體轉(zhuǎn)染方式角膜熒光強(qiáng)度與同濃度點(diǎn)眼方式差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與房水-角膜屏障和角膜上皮屏障有關(guān)。一方面，角膜內(nèi)皮細(xì)胞間形成緊密連接，不僅可阻止房水進(jìn)入細(xì)胞外間隙，具有角膜-房水屏障功能，而且能主動(dòng)泵出水分，阻止房水進(jìn)入角膜基質(zhì)內(nèi)而致角膜基質(zhì)層水腫，維持角膜相對脫水狀況。從采用結(jié)膜下注射的B、D兩組結(jié)果可以看出，通過房水進(jìn)入角膜的慢病毒主要集中在角膜內(nèi)皮層附近，且成團(tuán)狀分布。另一方面，角膜中成熟的上皮細(xì)胞分布于整個(gè)角膜上皮層，由角膜邊緣向角膜中心遷移，并覆蓋于角膜頂端，最頂端的角膜上皮細(xì)胞為緊密連接，限制了細(xì)胞間藥物的滲透以及病菌的通過[5]。從各組角膜熒光強(qiáng)度可以看出，EGFP主要表達(dá)于角膜上皮和角膜內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較少。另外，可能由于病毒量較少，MOI是根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量計(jì)算的，而內(nèi)皮細(xì)胞在角膜的3層結(jié)構(gòu)中數(shù)量最少，以致病毒數(shù)量不能保證整個(gè)角膜的細(xì)胞都能很好地感染病毒。A、C組以及B、D組在相同轉(zhuǎn)染途徑下，熒光強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明隨著病毒濃度升高，病毒轉(zhuǎn)染效率提高，EGFP在角膜上的表達(dá)增多。

在低MOI病毒感染情況下5組角膜細(xì)胞均未發(fā)生病理改變，各組角膜細(xì)胞形態(tài)完整，各層結(jié)構(gòu)清晰。采用離體方式對角膜進(jìn)行長時(shí)間持續(xù)轉(zhuǎn)染后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長良好，未見缺失，表明角膜在低MOI慢病毒感染條件下安全、無毒性。

慢病毒載體可以感染多種細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞[6]，更有研究指出，慢病毒載體可以轉(zhuǎn)染所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞[7]，表明可將其用于T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，以解決角膜移植免疫排斥反應(yīng)的問題。慢病毒載體的優(yōu)勢在于來源廣泛，易于大量獲得，感染效率較高，可穩(wěn)定而長期地表達(dá)目的基因，且不會引起非特異性反應(yīng)[8-9]。載體的正確選擇是轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)中使用的慢病毒來源為HIV-1。

轉(zhuǎn)染途徑是將慢病毒成功運(yùn)用于活體轉(zhuǎn)染的另一重要因素。由于眼球部位的特殊性，即其位于人體體表，且角膜位于眼球外層，使得角膜轉(zhuǎn)染途徑便利且易于觀察。從本實(shí)驗(yàn)來看，對比兩種眼科臨床最常用的給藥方式，點(diǎn)眼方式能更好地感染角膜。從給藥簡便性和患者依從性來看，點(diǎn)眼方式均明顯優(yōu)于侵入性操作的結(jié)膜下注射。本實(shí)驗(yàn)為點(diǎn)眼給藥途徑用于慢病毒轉(zhuǎn)染提供了良好的依據(jù)。

綜上所述，LV-EGFP能在較低MOI下有效轉(zhuǎn)染大鼠角膜，且點(diǎn)眼方式比結(jié)膜下注射的轉(zhuǎn)染效率更高，而提高M(jìn)OI可提高角膜轉(zhuǎn)染的效率，大鼠角膜在較低MOI下持續(xù)轉(zhuǎn)染的安全性良好。但本實(shí)驗(yàn)只探討了低MOI情況下慢病毒對角膜的毒性作用，如果需使用更高濃度的慢病毒用于角膜的基因治療，則需要對其遺傳毒性進(jìn)行更全面和深入的研究。

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