王立曼，王妍，段翠密，王海濱，王常勇

肝移植是有效根治肝衰竭的方法，然而供體來源有限、費(fèi)用昂貴等原因限制了肝移植的應(yīng)用[1]。體外再造肝臟有望為肝衰竭的治療提供新手段。近年來，基于全器官脫細(xì)胞-再細(xì)胞化策略的組織工程研究受到了越來越多的關(guān)注，發(fā)展異常迅速[2-6]。該策略的基礎(chǔ)是制備肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，保留完整的脈管結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu lar m atrix，ECM)成分，這是解決再造肝臟營養(yǎng)物質(zhì)輸送問題的關(guān)鍵[7-9]。研究人員相繼利用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsu lfate，SDS)[10]、磷脂酶和脫氧膽酸鈉[11]、不同濃度Triton X-100[12-14]成功獲得脫細(xì)胞基質(zhì)，但其洗脫方法均存在一定不足，如洗脫時間長、ECM破壞嚴(yán)重、生長因子大量丟失等[15]。此外，由于門靜脈容易暴露、插管后不宜扭轉(zhuǎn)，因此以往研究主要采用門靜脈灌注的方法[9-13]，但是門靜脈的管壁較薄，插管后血管很容易破裂，造成洗滌劑外泄。Pan等[16]于2013年采用肝下下腔靜脈灌注獲得脫細(xì)胞基質(zhì)，但肝下下腔靜脈灌注為逆行灌注，不符合生理學(xué)特征，靜脈瓣膜很可能對灌注帶來阻力。目前為止尚未見采用肝動脈插管的報道。本研究采用肝動脈插管的方式，比較不同方法對細(xì)胞和核酸成分的去除情況，以及對ECM蛋白成分的影響，以期為篩選更為有效的肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 SD大鼠購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，雌雄不限，體重200～300g。戊巴比妥鈉、肝素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胰蛋白酶(Sigm a公司，美國)；甲苯胺藍(lán)染液(北京化工廠)；Ⅳ型膠原抗體、纖連蛋白抗體和層黏連蛋白抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(30m g/kg)麻醉，十字切口打開腹腔，顯露門靜脈，注射器推注2m l肝素(100U/m l)抗凝。肝動脈行留置針固定，結(jié)扎門靜脈、肝上下腔靜脈，肝下下腔靜脈用于洗脫液的外流。游離肝臟周圍韌帶，切斷腔靜脈，取出完整肝臟。SDS方案：肝臟－80℃冷凍24h后常溫解凍，0.01m o l/L PBS灌注1h，1%SDS灌注3h，0.01m o l/L PBS沖洗24h。Tx(Triton X-100)+SDS方案：肝臟－80℃冷凍24h后常溫解凍，以0.01m o l/L PBS灌注1h，1%Triton X-100灌注3h，超純水沖洗15m in，0.1%SDS灌注2h，0.01m o l/L PBS沖洗24h。灌流速度均為3m l/m in。1.3 三維形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色 大鼠肝臟脫細(xì)胞前后行大體觀察。肝動脈灌流0.5%甲苯胺藍(lán)染液，灌流速度0.1m l/m in，體式顯微鏡下觀察脈管結(jié)構(gòu)保留情況。

1.4 HE染色及免疫熒光染色 4%多聚甲醛固定脫細(xì)胞基質(zhì)，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片(厚3μm)、脫蠟后行HE染色。另取切片脫蠟，3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶，修復(fù)，加1%牛血清白蛋白封閉，滴加Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、纖連蛋白一抗，4℃過夜；0.01m o l/L PBS清洗3次，Ⅳ型膠原、層黏連蛋白滴加山羊抗小鼠IgG-FITC生物素化二抗(1:200)，纖連蛋白滴加山羊抗小鼠IgG-Cy3生物素化二抗(1:200)，37℃孵育20m in；0.01m o l/L PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察(DM IRB，Leica，德國)。

1.5 DNA含量檢測 采用組織DNA基因組提取試劑盒(TIANGEN公司)提取天然組織和脫細(xì)胞基質(zhì)DNA，采用核酸電泳儀(Bio-Rad，美國)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad核酸蛋白測量儀(Bio-Rad Sm artspecTMPlus，北京賽百奧科技公司)進(jìn)行定量分析。

1.6 生長因子檢測 采用大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)ELISA試劑盒、大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b FGF)ELISA試劑盒(上海BLUEGENE生物科技有限公司)檢測HGF、b FGF含量。分別稱取100m g左右正常肝臟組織和脫細(xì)胞基質(zhì)，勻漿后取上清，設(shè)置空白對照組、標(biāo)準(zhǔn)品組、樣品組，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。測量450nm波長處各孔吸光度(A)值，計算HGF、b FGF含量。

1.7 膠原含量檢測 采用酸水解法測定羥脯氨酸含量以反映組織中的膠原含量。制備樣品處理液：稱取30m g左右的正常肝臟組織和脫細(xì)胞基質(zhì)，于安瓿瓶中加6m o l/L HCl，酒精燈火焰封口后110℃水解24h，然后調(diào)節(jié)pH至6.5～7.0。制備羥脯氨酸儲備液(1m g/m l)，并稀釋成梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)液(0、2、4、6、8、10μg/m l)。分別取標(biāo)準(zhǔn)液和樣品處理液0.5m l，依次加入2m l正丙醇和0.5m l氯胺T試劑，室溫放置25m in，然后加入0.5m l恩克里試劑，混勻后65℃水浴20m in。冷卻后560nm下測量A值，計算膠原蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Studen t t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三維形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 肝臟經(jīng)兩種灌注方法洗脫后，外形結(jié)構(gòu)保持良好，期間逐漸變白并透明化(圖1)。肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)包膜結(jié)構(gòu)完整，透過肝包膜可以清晰地看到脈管結(jié)構(gòu)。甲苯胺藍(lán)染色顯示，SDS方案脫細(xì)胞化會對脈管壁造成損害，灌入的染液外泄，而Tx+SDS方案保持了脈管結(jié)構(gòu)的完整性，染液從血管根部一直流向血管分支(圖2)。

2.2 組織學(xué)檢測結(jié)果 HE染色未見明顯的細(xì)胞及細(xì)胞成分，肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。免疫熒光染色顯示兩種脫細(xì)胞方法均能很好地移除細(xì)胞核成分，并能保留ECM成分(圖4)。SDS方案得到的支架纖維結(jié)構(gòu)松散，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到不同程度破壞，未見完整的脈管系統(tǒng)，Tx+SDS方案保留了完好的ECM網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脈管系統(tǒng)保留完整(圖3、4)。

圖1 肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)制備過程(Bar=10mm)Fig. 1 Decellu larization fo r p reparing liver w ho le-o rgan dece llu larized m atrix (Bar=10mm)

圖2 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)甲苯胺藍(lán)染色(Bar=10mm)Fig. 2 Toluidine blue staining of liver whole-organ decellularized m atrix (Bar=10mm)

2.3 DNA含量 正常肝臟組織中DNA含量為2955.0±138.1μg/g，SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA含量為47.4±3.0μg/g，為正常組織的1.60%，Tx+SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA含量為46.8±4.3μg/g，為正常組織的1.58%。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，兩種方案脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA含量均明顯低于正常肝臟組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。瓊脂糖凝膠電泳未見脫細(xì)胞基質(zhì)中有明顯的DNA片段(圖5)。

圖3 正常肝臟及肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)HE染色(Bar=100μm)Fig. 3 HE staining of no rm al liver and liver w ho le-o rgan dece llu larized m atrix (Bar=100μm)

2.4 ECM中膠原及HGF、b FGF的含量 SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中膠原含量為4.23±0.05μg/m g，明顯低于正常組織中的膠原含量(7.54±0.11μg/m g，P<0.05)，表明SDS脫細(xì)胞方法會破壞ECM膠原蛋白成分；Tx+SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中膠原含量為7.76±0.15μg/m g，與正常組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明Tx+SDS方案能夠很好地保留膠原蛋白成分。SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中HGF含量為11.3±1.8ng/g，明顯低于Tx+SDS方案(44.5±2.9ng/g)及正常組織(76.1±4.1ng/g)，且Tx+SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中HGF含量明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中b FGF含量為6.1±0.7ng/g，明顯低于Tx+SDS方案(15.9±0.4ng/g)及正常組織(37.6±3.3ng/g)，且Tx+SDS方案脫細(xì)胞基質(zhì)中b FGF含量明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

本研究采用SDS及Tx+SDS方案進(jìn)行洗脫，均可見肝臟逐步變得透明，但三維結(jié)構(gòu)保持不變。HE染色、免疫熒光染色均未見細(xì)胞及細(xì)胞核殘留，DNA含量分別減少至天然組織的1.60%和1.58%，表明兩種方案制備的肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)[17]，證實(shí)了肝動脈插管的可行性及兩種脫細(xì)胞方法的有效性。但是兩種方法的脫細(xì)胞化效果不盡相同：甲苯胺藍(lán)、免疫熒光及膠原定量檢測結(jié)果表明，SDS方案對ECM成分破壞較大，纖維結(jié)構(gòu)松散，脈管結(jié)構(gòu)不完整，而Tx+SDS方案對ECM成分破壞則較小，維持了肝臟天然的ECM成分和脈管結(jié)構(gòu)。此外，ELISA檢測結(jié)果顯示，相對于SDS方案，Tx+SDS方案可以保留更多的ECM及生長因子成分。

圖4 正常肝臟及肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)免疫熒光(Bar=100μm)Fig. 4 Imm unefluo rescence of no rm al liver and liver w ho le-o rgan decellu larized m atrix (Bar=100μm)

圖5 肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)DNA含量檢測Fig. 5 Determ ination of DNA content of liver w hole-organ decellu larized m atrix

本研究采用的脫細(xì)胞方法結(jié)合了物理法和化學(xué)法。凍融法是常用的物理脫細(xì)胞方法，在冰凍過程中，溶液會形成冰晶，細(xì)胞內(nèi)的小冰晶可脹破細(xì)胞膜，有效地破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是必需聯(lián)合其他方法來清除細(xì)胞成分。SDS是廣泛使用的離子洗滌劑，能溶解細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜，可高效清除細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白殘留。本研究中SDS方案有效清除了細(xì)胞成分，但ECM成分也遭到了嚴(yán)重破壞，這可能是由于SDS破壞了蛋白之間的聯(lián)系，使蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)松散。Triton X-100是一種溫和的非離子洗滌劑，能夠與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，破壞生物膜，它打破了脂質(zhì)之間和脂質(zhì)與蛋白間的聯(lián)系，但保留了蛋白與蛋白之間的聯(lián)系，因此，以Triton X-100為主要洗滌劑的脫細(xì)胞方案能夠更好地保護(hù)肝臟超微結(jié)構(gòu)和ECM蛋白成分。但單純的Triton X-100過于溫和，洗脫不完全，因此我們結(jié)合SDS進(jìn)一步洗脫以完全去除細(xì)胞殘留成分，SDS的濃度控制在0.1%，既能發(fā)揮很好的洗脫作用，又能較好地保留ECM蛋白[18]。

總體來說，通過Tx+SDS方案制備肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)能夠更好地保留肝臟三維結(jié)構(gòu)和ECM蛋白成分，維持肝臟ECM的力學(xué)、生物學(xué)特性，為基于肝臟全器官脫細(xì)胞-再細(xì)胞化策略的肝臟再造提供了優(yōu)良的肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)材料，有望成為臨床上移植供肝的重要來源之一。

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