楊蕊珂，楊麗紅，王淑輝，喬鵬，徐金義，李涵，張強

基礎(chǔ)與實驗研究

微小核糖核酸-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控*

楊蕊珂，楊麗紅，王淑輝，喬鵬，徐金義，李涵，張強

目的: 探討微小核糖核酸-34（amiRNA-34a）對左心室肥厚大鼠心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控及其意義。

心肌肥厚; 微小核糖核酸-34a; 肌球蛋白重鏈α

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:138.)

心肌肥厚是心肌對長期壓力超負荷、內(nèi)分泌激活、能量代謝障礙等刺激因素的代償表現(xiàn)。肥厚心肌結(jié)構(gòu)功能的改變與肌球蛋白“胚胎化” 密切相關(guān)，即肌球蛋白重鏈α基因表達下調(diào)，肌球蛋白重鏈β基因表達上調(diào)，這一過程受多種微小核糖核酸（miRNA）調(diào)控[1]。通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站，美國國家生物技術(shù)信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫查找結(jié)果顯示，肌球蛋白重鏈α基因表達可能受miRNA-34a調(diào)控，本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)建立左心室肥厚大鼠模型，探討miRNA-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控作用，以及對肥厚心肌組織結(jié)構(gòu)及功能的影響。

1 材料與方法

阻遏物及其陰性對照物： miRNA-34a表達阻遏物經(jīng)鎖核酸修飾的可皮下釋放的改良寡聚核苷酸（LNA-antimiRNA-34a）[2]，miRNA-34a序列打亂后形成的陰性對照物（LNA-contrl-34a）, 均購自上海生工生物有限公司。

動物模型建立及分組：2013-02由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供健康12周齡雄性SD大鼠40只，體重250～320 g。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組10只。分別為腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/AAC組），腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/AAC組），假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/SH組），假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/SH組）。ant-34a/AAC組和con/AAC組行腹主動脈縮窄術(shù)建立左心室肥厚大鼠模型[3]：以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹，分離腹主動脈，在右腎動脈上方腹主動脈處用5～0縫線將其與外徑為0.6 mm的注射器針頭一并扎緊，迅速將針頭移去，逐層縫合關(guān)腹；ant-34a/SH組和con/SH組穿線不結(jié)扎，其他手術(shù)處理與前兩組相同。4組大鼠術(shù)后均給予青霉素5000 U/只,肌肉注射1周，預(yù)防感染。各組分籠飼養(yǎng)5周后從第6周開始每周1、3、5，ant-34a/AAC組和ant-34a/SH組分別皮下注射25 mg/kg LNA-antimiR-34a，con/AAC組和con/SH組分別皮下注射25 mg/ kg LNA-contrl-34a，連續(xù)注射6周[4]。第12周存活大鼠：ant-34a/AAC組6只，con/AAC組7只，ant-34a/SH組8只，con/SH組8只。

血流動力學(xué)參數(shù)及心肌肥厚指數(shù)測定：大鼠稱重后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)頸動脈插管至左心室，用PowerLab/4SP型生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄左心室收縮壓,左心室舒張末期壓以及壓力最大變化速率；檢測完畢后，開胸迅速取出心臟，置入冰生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱取全心重量，取左心室及室間隔稱重，并計算心肌肥厚指數(shù)：心重指數(shù)=全心重量（mg）/體重（g），左心指數(shù)=左心室重量（mg）/體重（g）。將左心室心肌組織分為兩部分，一部分放入無菌凍存管中并置于液氮罐中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存；另一部分放置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出，常規(guī)石蠟包埋備用。

心肌組織病理學(xué)觀察：各組大鼠心肌組織蠟塊切片，蘇木素伊紅染色，在光鏡（×200）下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

心肌組織miRNA-34a，肌球蛋白重鏈α基因表達的測定：Trizol法提取總RNA,使用Applied Biosystems 7300型PCR基因擴增儀進行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR)， miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因相對表達倍數(shù)按2-△△Ct計算。引物序列見表1。

表1 引物序列表

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組計量資料間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRTPCR結(jié)果比較：與con/AAC組相比， ant-34a/AAC組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低，壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（P均＜0.05）。與con/AAC組相比，con/SH組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低,壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 （P均＜0.05）。與con/SH組相比， ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低，肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 （P均＜0.05），心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表2

心肌組織病理學(xué)觀察：ant-34a/SH組（圖1C）和con/SH組（圖1D）心肌細胞排列整齊，大小正常，胞漿均勻，胞核染色均勻，胞外基質(zhì)膠原沉淀少，無炎癥細胞浸潤；con/AAC組（圖1B）大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞明顯肥大增寬,細胞漿濃染，細胞間距增大,胞外較多膠質(zhì)沉積。ant-34a/AAC組（圖1A）病理學(xué)表現(xiàn)介于兩個SH組與con/AAC組之間。

表2 各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結(jié)果比較

表2 各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結(jié)果比較

注：與con/AAC組比*P＜0.05，與con/SH組比△P＜0.05。ant-34a/AAC組：腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物組；con/AAC組：腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組；ant-34a/SH組：假手術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物組；con/SH組：假手術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組；α-MHC：肌球蛋白重鏈α；qRT-PCR：熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。1 mmHg=0.133 kPa。余注見表1

組別 con/AAC組 (n=7) ant-34a/AAC組 (n=6) con/SH組 (n=8) ant-34a/SH組 (n=8)血流動力學(xué)參數(shù)左心室收縮壓(mmHg) 145.93±6.83 138.36±5.73* 130.55±5.73* 128.96±7.45左心室舒張末期壓(mmHg) 6.63±0.32 5.67±0.36* 4.41±0.36* 4.49±0.36壓力最大上升速率(mmHg/s) 5681.04±92.19 6237.42±37.50* 6734.09±82.78* 6723.09±85.37壓力最大下降速率(mmHg/s) 4632.04±138.70 4938.84±105.46* 5221.86±145.11* 5256.45±125.43心肌肥厚指數(shù)體重 (g) 406.151±37.673 405.557±38.764 406.415±30.626 405.714±31.454心重指數(shù) (mg/g) 3.453±0.256 3.325±0.263* 3.012±0.124* 3.022±0.241左心指數(shù) (mg/g) 2.531±0.254 2.404±0.341* 2.134±0.213* 2.021±0.102 qRT-PCR結(jié)果miRNA-34a相對表達量 1.03±0.26 0.18±0.22* 0.49±0.17* 0.06±0.12△α-MHC基因相對表達量 0.81±0.21 1.13±0.37* 1.61±0.29* 1.74±0.36△

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)（×200）

3 討論

心肌肥厚表現(xiàn)為心肌細胞肥大、細胞外基質(zhì)膠質(zhì)沉積和纖維化等一系列病理生理變化。各種因素引起的心肌肥厚，均伴隨著肌球蛋白重鏈胚胎基因的激活和異常表達[5]。

肌球蛋白是心肌重要的收縮蛋白，主要由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，哺乳動物心肌肌球蛋白重鏈由肌球蛋白重鏈α和β基因編碼，其表達產(chǎn)物構(gòu)成三種二聚體，即α-α同二聚體（V1型）、αβ-異二聚體（V2型）和β-β（V3型）同二聚體，三者的三磷酸腺苷酶活性及收縮活性依次降低。心肌肥厚發(fā)生的主要組織學(xué)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是心肌細胞肌球蛋白重鏈基因表達向“胚胎型”轉(zhuǎn)變[6]，即肌球蛋白重鏈α基因表達下調(diào)伴隨著肌球蛋白重鏈β基因表達上調(diào)，二聚體由V1型向V3型轉(zhuǎn)化，肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性下降，心肌收縮功能降低。肌球蛋白重鏈α基因的表達對維持心肌正常的收縮功能起重要作用，近年來，通過靶向調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈α基因表達，逆轉(zhuǎn)或減慢心肌肥厚進程成為治療高血壓性心臟病、肥厚性心肌病、心力衰竭等的新熱點[7]。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的15～22 bp的非編碼單鏈RNA分子，通過結(jié)合靶基因mRNA的3＇非編碼區(qū)而對其表達進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控[8]。目前，已經(jīng)證實miRNA在心肌病理重塑、缺血后損傷修復(fù)等病理生理機制中具有重要作用[9-11]。經(jīng)基因檢索發(fā)現(xiàn)，哺乳動物肌球蛋白重鏈α基因為miRNA-34a下游靶基因，Bernardo等[4]研究表明，阻斷miRNA-34家族在大鼠肥厚心肌中的表達，可能對心肌重構(gòu)及功能減退有保護作用，本研究在其基礎(chǔ)上通過靶向阻斷miRNA-34a在心肌的表達，觀察其對肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控作用。結(jié)果表明miRNA-34a在腹主動脈縮窄術(shù)后大鼠肥厚心肌中表達明顯上調(diào)，伴隨肌球蛋白重鏈α基因表達下降以及心肌收縮舒張功能的減退，通過兩組腹主動脈縮窄模型大鼠比較證明通過靶向阻斷miRNA-34a表達可上調(diào)肌球蛋白重鏈α基因表達，抑制心肌向“胚胎型”轉(zhuǎn)變，減慢心肌肥厚進程。

心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素，臨床流行病學(xué)資料顯示高血壓合并左心室肥厚使心血管疾病發(fā)生率明顯增加[12]?，F(xiàn)有的治療措施只是延緩而不是阻止和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚進程，其最終轉(zhuǎn)歸都是不可逆的心臟泵衰竭[13]，而β受體阻滯劑、血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物往往存在電解質(zhì)紊亂、肝腎功能損害、低血壓、加重心力衰竭等副作用[14]，隨著miRNA-34家族在心肌細胞生長[15]、心肌肥厚[16]、病理重構(gòu)[17]等方面的調(diào)節(jié)作用，及其在活體容易被阻斷的特性被逐漸了解[18]，同時隨著反義寡核苷酸化學(xué)和反義治療技術(shù)的發(fā)展通過靶向阻斷miRNA-34a表達[19]，上調(diào)肌球蛋白重鏈α基因的表達，減緩或者逆轉(zhuǎn)心肌肥厚進程，改善心功能的治療潛能被看好[18-20]。

由于哺乳動物心室肌肌球蛋白異構(gòu)體的分布與種屬、年齡等因素有關(guān)，有待進一步研究明確miRNA-34a在人體內(nèi)對肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控機制,同時還需要大量研究明確反義治療可能存在的不良靶目標外作用，為進一步應(yīng)用于臨床提供可靠依據(jù)。

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Regulation of MicroRNA-34a on Myosin Heavy Chain-α Expression in Rats With Left Ventricular Hypertrophic Tissue

YANG Rui-ke, YANG Li-hong, WANG Shu-hui, QIAO Peng, XU Jin-yi, LI Han, ZHANG Qiang.

Department of Cardiology, the Second Aff i liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450014), Henan, China Corresponding Author: ZHANG Qiang, Email: zq3397@163.com

Objective: To explore the regulation effect of microRNA-34a (miR-34a) on myosin heavy chain α (α-MHC) expression in rats of left ventricular hypertrophic tissue with overloaded pressure.Methods: The cardiac hypertrophy rats’ model was established by abdominal aortic constriction (AAC), and 40 SD rats were randomly divided into 4 groups. ①AAC rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/AAC) group, ②AAC rats with LNA-control-34a (con/AAC) group, and ③sham operation rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/SH) group, ④con/ SH group. n=10 in each group. With 12 weeks treatment, the surviving conditions were as 6 in ant-34a/AAC group, 7 in con/AAC group, and 8 in ant-34a/SH group, 8 in con/SH group. The left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular eud distolic pressure (LVEDP), the maximum changing rate of pressure (±LVdp/dt)max, heart weight index (HM/ BM) and cardiac index (LVM/BM) were calculated, the pathological changes of myocardial tissue was observed and the expressions of miR-34a and α-MHC in the left ventricular tissue were analyzed.Results: Compared with con/AAC group, the ant-34a/AAC group had decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P<0.05. Compared with con/AAC group, the con/SH group showed decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P＜0.05. Compared with con/SH group, the ant-34a/SH group presented decreased miR-34a expression and increased α-MHC expression, both P<0.05; the HM/BM, LVSP, LVEDP and (±LVdp/dt)max were similar, all P>0.05.Conclusion: The rats of left ventricular hypertrophy with overloaded pressure had increased miR-34a and decreased α-MHC, LNA-anti-miR-34a could elevate α-MHC expression and therefore, reduce or delay the myocardial hypertrophy and improve the cardiac function.

Ventricular hypertrophic; MicroRNA-34a; Myosin heavy chain-α

2013-08-22）

（編輯：王寶茹）

河南省科技廳科研基金（72102310023）

450014 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（楊蕊珂、王淑輝、張強），心電圖科（楊麗紅）；鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室（喬鵬）； 河南省人民醫(yī)院（徐金義、李涵）

楊蕊珂 碩士研究生 主要從事高血壓相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究 Email: qiaoyangguo@163.com 通訊作者：張強Email: zq3397@163.com

R54

A

1000-3614（2014）02-0138-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.02.015

方法: 將40只雄性SD大鼠隨機分為4組（n=10），分別為腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/AAC組），腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/AAC組），假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/SH組）， 假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/SH組）。模型建立第12周存活大鼠：ant-34a/AAC組6只，con/AAC組7只，ant-34a/SH組8只，con/SH組8只。測定各組大鼠左心室收縮壓、左心室舒張末期壓及壓力最大變化速率，計算心肌肥厚指數(shù)，觀察心肌組織病理學(xué)改變，應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ qRT-PCR）檢測大鼠左心室心肌組織miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因表達水平。

結(jié)果：與con/AAC組相比， ant-34a/AAC組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低，壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（P均＜0.05）。與con/AAC組相比，con/SH組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低，壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（ P均＜0.05）。與con/SH組相比，ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低，肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（ P均＜0.05），心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)論：壓力負荷性左心室肥厚大鼠心肌組織中 miRNA-34a表達上調(diào)，肌球蛋白重鏈α基因表達減少，利用特異性阻遏物阻斷 miRNA-34a表達可使大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達水平增高，減輕或者延緩心肌肥厚、提高心肌順應(yīng)性、改善心功能。