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        微小核糖核酸-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控*

        2014-03-02 08:41:12楊蕊珂楊麗紅王淑輝喬鵬徐金義李涵張強
        中國循環(huán)雜志 2014年2期

        楊蕊珂,楊麗紅,王淑輝,喬鵬,徐金義,李涵,張強

        基礎(chǔ)與實驗研究

        微小核糖核酸-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控*

        楊蕊珂,楊麗紅,王淑輝,喬鵬,徐金義,李涵,張強

        目的: 探討微小核糖核酸-34(amiRNA-34a)對左心室肥厚大鼠心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控及其意義。

        心肌肥厚; 微小核糖核酸-34a; 肌球蛋白重鏈α

        (Chinese Circulation Journal, 2014,29:138.)

        心肌肥厚是心肌對長期壓力超負荷、內(nèi)分泌激活、能量代謝障礙等刺激因素的代償表現(xiàn)。肥厚心肌結(jié)構(gòu)功能的改變與肌球蛋白“胚胎化” 密切相關(guān),即肌球蛋白重鏈α基因表達下調(diào),肌球蛋白重鏈β基因表達上調(diào),這一過程受多種微小核糖核酸(miRNA)調(diào)控[1]。通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站,美國國家生物技術(shù)信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫查找結(jié)果顯示,肌球蛋白重鏈α基因表達可能受miRNA-34a調(diào)控,本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)建立左心室肥厚大鼠模型,探討miRNA-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控作用,以及對肥厚心肌組織結(jié)構(gòu)及功能的影響。

        1 材料與方法

        阻遏物及其陰性對照物: miRNA-34a表達阻遏物經(jīng)鎖核酸修飾的可皮下釋放的改良寡聚核苷酸(LNA-antimiRNA-34a)[2],miRNA-34a序列打亂后形成的陰性對照物(LNA-contrl-34a), 均購自上海生工生物有限公司。

        動物模型建立及分組:2013-02由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供健康12周齡雄性SD大鼠40只,體重250~320 g。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組,每組10只。分別為腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組(ant-34a/AAC組),腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組(con/AAC組),假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組(ant-34a/SH組),假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組(con/SH組)。ant-34a/AAC組和con/AAC組行腹主動脈縮窄術(shù)建立左心室肥厚大鼠模型[3]:以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹,分離腹主動脈,在右腎動脈上方腹主動脈處用5~0縫線將其與外徑為0.6 mm的注射器針頭一并扎緊,迅速將針頭移去,逐層縫合關(guān)腹;ant-34a/SH組和con/SH組穿線不結(jié)扎,其他手術(shù)處理與前兩組相同。4組大鼠術(shù)后均給予青霉素5000 U/只,肌肉注射1周,預(yù)防感染。各組分籠飼養(yǎng)5周后從第6周開始每周1、3、5,ant-34a/AAC組和ant-34a/SH組分別皮下注射25 mg/kg LNA-antimiR-34a,con/AAC組和con/SH組分別皮下注射25 mg/ kg LNA-contrl-34a,連續(xù)注射6周[4]。第12周存活大鼠:ant-34a/AAC組6只,con/AAC組7只,ant-34a/SH組8只,con/SH組8只。

        血流動力學(xué)參數(shù)及心肌肥厚指數(shù)測定:大鼠稱重后,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)頸動脈插管至左心室,用PowerLab/4SP型生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄左心室收縮壓,左心室舒張末期壓以及壓力最大變化速率;檢測完畢后,開胸迅速取出心臟,置入冰生理鹽水漂洗,濾紙吸干,稱取全心重量,取左心室及室間隔稱重,并計算心肌肥厚指數(shù):心重指數(shù)=全心重量(mg)/體重(g),左心指數(shù)=左心室重量(mg)/體重(g)。將左心室心肌組織分為兩部分,一部分放入無菌凍存管中并置于液氮罐中,然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存;另一部分放置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出,常規(guī)石蠟包埋備用。

        心肌組織病理學(xué)觀察:各組大鼠心肌組織蠟塊切片,蘇木素伊紅染色,在光鏡(×200)下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

        心肌組織miRNA-34a,肌球蛋白重鏈α基因表達的測定:Trizol法提取總RNA,使用Applied Biosystems 7300型PCR基因擴增儀進行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR), miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因相對表達倍數(shù)按2-△△Ct計算。引物序列見表1。

        表1 引物序列表

        統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組計量資料間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRTPCR結(jié)果比較:與con/AAC組相比, ant-34a/AAC組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低,壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高(P均<0.05)。與con/AAC組相比,con/SH組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低,壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 (P均<0.05)。與con/SH組相比, ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低,肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 (P均<0.05),心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表2

        心肌組織病理學(xué)觀察:ant-34a/SH組(圖1C)和con/SH組(圖1D)心肌細胞排列整齊,大小正常,胞漿均勻,胞核染色均勻,胞外基質(zhì)膠原沉淀少,無炎癥細胞浸潤;con/AAC組(圖1B)大鼠心肌細胞排列紊亂,心肌細胞明顯肥大增寬,細胞漿濃染,細胞間距增大,胞外較多膠質(zhì)沉積。ant-34a/AAC組(圖1A)病理學(xué)表現(xiàn)介于兩個SH組與con/AAC組之間。

        表2 各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結(jié)果比較

        表2 各組血流動力學(xué)參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結(jié)果比較

        注:與con/AAC組比*P<0.05,與con/SH組比△P<0.05。ant-34a/AAC組:腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物組;con/AAC組:腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組;ant-34a/SH組:假手術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物組;con/SH組:假手術(shù)后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組;α-MHC:肌球蛋白重鏈α;qRT-PCR:熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。1 mmHg=0.133 kPa。余注見表1

        組別 con/AAC組 (n=7) ant-34a/AAC組 (n=6) con/SH組 (n=8) ant-34a/SH組 (n=8)血流動力學(xué)參數(shù)左心室收縮壓(mmHg) 145.93±6.83 138.36±5.73* 130.55±5.73* 128.96±7.45左心室舒張末期壓(mmHg) 6.63±0.32 5.67±0.36* 4.41±0.36* 4.49±0.36壓力最大上升速率(mmHg/s) 5681.04±92.19 6237.42±37.50* 6734.09±82.78* 6723.09±85.37壓力最大下降速率(mmHg/s) 4632.04±138.70 4938.84±105.46* 5221.86±145.11* 5256.45±125.43心肌肥厚指數(shù)體重 (g) 406.151±37.673 405.557±38.764 406.415±30.626 405.714±31.454心重指數(shù) (mg/g) 3.453±0.256 3.325±0.263* 3.012±0.124* 3.022±0.241左心指數(shù) (mg/g) 2.531±0.254 2.404±0.341* 2.134±0.213* 2.021±0.102 qRT-PCR結(jié)果miRNA-34a相對表達量 1.03±0.26 0.18±0.22* 0.49±0.17* 0.06±0.12△α-MHC基因相對表達量 0.81±0.21 1.13±0.37* 1.61±0.29* 1.74±0.36△

        圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)(×200)

        3 討論

        心肌肥厚表現(xiàn)為心肌細胞肥大、細胞外基質(zhì)膠質(zhì)沉積和纖維化等一系列病理生理變化。各種因素引起的心肌肥厚,均伴隨著肌球蛋白重鏈胚胎基因的激活和異常表達[5]。

        肌球蛋白是心肌重要的收縮蛋白,主要由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成,哺乳動物心肌肌球蛋白重鏈由肌球蛋白重鏈α和β基因編碼,其表達產(chǎn)物構(gòu)成三種二聚體,即α-α同二聚體(V1型)、αβ-異二聚體(V2型)和β-β(V3型)同二聚體,三者的三磷酸腺苷酶活性及收縮活性依次降低。心肌肥厚發(fā)生的主要組織學(xué)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是心肌細胞肌球蛋白重鏈基因表達向“胚胎型”轉(zhuǎn)變[6],即肌球蛋白重鏈α基因表達下調(diào)伴隨著肌球蛋白重鏈β基因表達上調(diào),二聚體由V1型向V3型轉(zhuǎn)化,肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性下降,心肌收縮功能降低。肌球蛋白重鏈α基因的表達對維持心肌正常的收縮功能起重要作用,近年來,通過靶向調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈α基因表達,逆轉(zhuǎn)或減慢心肌肥厚進程成為治療高血壓性心臟病、肥厚性心肌病、心力衰竭等的新熱點[7]。

        miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的15~22 bp的非編碼單鏈RNA分子,通過結(jié)合靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)而對其表達進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控[8]。目前,已經(jīng)證實miRNA在心肌病理重塑、缺血后損傷修復(fù)等病理生理機制中具有重要作用[9-11]。經(jīng)基因檢索發(fā)現(xiàn),哺乳動物肌球蛋白重鏈α基因為miRNA-34a下游靶基因,Bernardo等[4]研究表明,阻斷miRNA-34家族在大鼠肥厚心肌中的表達,可能對心肌重構(gòu)及功能減退有保護作用,本研究在其基礎(chǔ)上通過靶向阻斷miRNA-34a在心肌的表達,觀察其對肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控作用。結(jié)果表明miRNA-34a在腹主動脈縮窄術(shù)后大鼠肥厚心肌中表達明顯上調(diào),伴隨肌球蛋白重鏈α基因表達下降以及心肌收縮舒張功能的減退,通過兩組腹主動脈縮窄模型大鼠比較證明通過靶向阻斷miRNA-34a表達可上調(diào)肌球蛋白重鏈α基因表達,抑制心肌向“胚胎型”轉(zhuǎn)變,減慢心肌肥厚進程。

        心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素,臨床流行病學(xué)資料顯示高血壓合并左心室肥厚使心血管疾病發(fā)生率明顯增加[12]?,F(xiàn)有的治療措施只是延緩而不是阻止和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚進程,其最終轉(zhuǎn)歸都是不可逆的心臟泵衰竭[13],而β受體阻滯劑、血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物往往存在電解質(zhì)紊亂、肝腎功能損害、低血壓、加重心力衰竭等副作用[14],隨著miRNA-34家族在心肌細胞生長[15]、心肌肥厚[16]、病理重構(gòu)[17]等方面的調(diào)節(jié)作用,及其在活體容易被阻斷的特性被逐漸了解[18],同時隨著反義寡核苷酸化學(xué)和反義治療技術(shù)的發(fā)展通過靶向阻斷miRNA-34a表達[19],上調(diào)肌球蛋白重鏈α基因的表達,減緩或者逆轉(zhuǎn)心肌肥厚進程,改善心功能的治療潛能被看好[18-20]。

        由于哺乳動物心室肌肌球蛋白異構(gòu)體的分布與種屬、年齡等因素有關(guān),有待進一步研究明確miRNA-34a在人體內(nèi)對肌球蛋白重鏈α基因表達的調(diào)控機制,同時還需要大量研究明確反義治療可能存在的不良靶目標外作用,為進一步應(yīng)用于臨床提供可靠依據(jù)。

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        Regulation of MicroRNA-34a on Myosin Heavy Chain-α Expression in Rats With Left Ventricular Hypertrophic Tissue

        YANG Rui-ke, YANG Li-hong, WANG Shu-hui, QIAO Peng, XU Jin-yi, LI Han, ZHANG Qiang.

        Department of Cardiology, the Second Aff i liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450014), Henan, China Corresponding Author: ZHANG Qiang, Email: zq3397@163.com

        Objective: To explore the regulation effect of microRNA-34a (miR-34a) on myosin heavy chain α (α-MHC) expression in rats of left ventricular hypertrophic tissue with overloaded pressure.Methods: The cardiac hypertrophy rats’ model was established by abdominal aortic constriction (AAC), and 40 SD rats were randomly divided into 4 groups. ①AAC rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/AAC) group, ②AAC rats with LNA-control-34a (con/AAC) group, and ③sham operation rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/SH) group, ④con/ SH group. n=10 in each group. With 12 weeks treatment, the surviving conditions were as 6 in ant-34a/AAC group, 7 in con/AAC group, and 8 in ant-34a/SH group, 8 in con/SH group. The left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular eud distolic pressure (LVEDP), the maximum changing rate of pressure (±LVdp/dt)max, heart weight index (HM/ BM) and cardiac index (LVM/BM) were calculated, the pathological changes of myocardial tissue was observed and the expressions of miR-34a and α-MHC in the left ventricular tissue were analyzed.Results: Compared with con/AAC group, the ant-34a/AAC group had decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P<0.05. Compared with con/AAC group, the con/SH group showed decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P<0.05. Compared with con/SH group, the ant-34a/SH group presented decreased miR-34a expression and increased α-MHC expression, both P<0.05; the HM/BM, LVSP, LVEDP and (±LVdp/dt)max were similar, all P>0.05.Conclusion: The rats of left ventricular hypertrophy with overloaded pressure had increased miR-34a and decreased α-MHC, LNA-anti-miR-34a could elevate α-MHC expression and therefore, reduce or delay the myocardial hypertrophy and improve the cardiac function.

        Ventricular hypertrophic; MicroRNA-34a; Myosin heavy chain-α

        2013-08-22)

        (編輯:王寶茹)

        河南省科技廳科研基金(72102310023)

        450014 河南省鄭州市,鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科(楊蕊珂、王淑輝、張強),心電圖科(楊麗紅);鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室(喬鵬); 河南省人民醫(yī)院(徐金義、李涵)

        楊蕊珂 碩士研究生 主要從事高血壓相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究 Email: qiaoyangguo@163.com 通訊作者:張強Email: zq3397@163.com

        R54

        A

        1000-3614(2014)02-0138-04

        10.3969/j.issn.1000-3614.2014.02.015

        方法: 將40只雄性SD大鼠隨機分為4組(n=10),分別為腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組(ant-34a/AAC組),腹主動脈縮窄術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組(con/AAC組),假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組(ant-34a/SH組), 假手術(shù)后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組(con/SH組)。模型建立第12周存活大鼠:ant-34a/AAC組6只,con/AAC組7只,ant-34a/SH組8只,con/SH組8只。測定各組大鼠左心室收縮壓、左心室舒張末期壓及壓力最大變化速率,計算心肌肥厚指數(shù),觀察心肌組織病理學(xué)改變,應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( qRT-PCR)檢測大鼠左心室心肌組織miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因表達水平。

        結(jié)果:與con/AAC組相比, ant-34a/AAC組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低,壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高(P均<0.05)。與con/AAC組相比,con/SH組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低,壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高( P均<0.05)。與con/SH組相比,ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低,肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高( P均<0.05),心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        結(jié)論:壓力負荷性左心室肥厚大鼠心肌組織中 miRNA-34a表達上調(diào),肌球蛋白重鏈α基因表達減少,利用特異性阻遏物阻斷 miRNA-34a表達可使大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達水平增高,減輕或者延緩心肌肥厚、提高心肌順應(yīng)性、改善心功能。

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