楊紅遠，洪瓊花，權(quán)國波

（云南省畜牧獸醫(yī)科學院，昆明650224）

雌激素對體外培養(yǎng)皮膚毛囊影響的研究

楊紅遠，洪瓊花，權(quán)國波

（云南省畜牧獸醫(yī)科學院，昆明650224）

為觀察體外培養(yǎng)綿羊皮膚對外源雌激素加入后的反應，實驗對新鮮皮膚、加入雌激素后培養(yǎng)的皮膚和對照組之間通過HE和免疫組化染色的結(jié)果進行了比較。結(jié)果表明：在HE染色中，加入0．5 μg/mL雌激素組和對照組之間沒有差異，但是它們與新鮮皮膚相比均出現(xiàn)了皮膚結(jié)構(gòu)的破壞；在免疫組化染色中，加入0．5 μg/mL雌激素組皮膚毛囊和皮脂腺普遍出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，而對照組與新鮮皮膚組則無。表明0．5 μg/mL雌激素濃度將導致皮膚毛囊及皮脂腺的凋亡。

HE染色；免疫組化染色；毛囊；凋亡

羊毛是重要的畜牧業(yè)產(chǎn)品和工業(yè)原料，羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量不僅對畜牧生產(chǎn)效率有重要影響，而且在工業(yè)上也有重要的經(jīng)濟價值。環(huán)境應激能夠明顯調(diào)節(jié)皮膚內(nèi)神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫反應［1］。毛發(fā)的生長受激素調(diào)節(jié)，而這常常與個體的年齡、發(fā)育或環(huán)境的變化同步。激素指導毛囊的內(nèi)在變化，在下一個毛囊周期中使毛發(fā)類型與內(nèi)外的變化相適應。外界的刺激如季節(jié)性的繁殖活動［2］、營養(yǎng)水平都能影響毛發(fā)類型［3］。人們早就有充分的證據(jù)證明雌激素通過它分布在皮膚中的受體對皮膚的各個結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的影響，因為性腺切除小鼠促進了毛囊生長期的加快［4］。近年來的研究表明，在小鼠皮膚的局部應用雌二醇會導致毛發(fā)生長的停止，并使毛囊加速進入退行期，如果拮抗了雌激素的作用，則小鼠的毛發(fā)又進入早期生長［5］。但是，雌激素對毛囊的作用機理人們了解尚不清晰，有待進一步研究。

1 材料與方法

1．1 材料來源

本實驗所需綿羊皮膚取自昆明市易興恒公司團結(jié)鄉(xiāng)種羊場健康成年半細毛羊。剪去肩部羊毛后用碘酒、75%的乙醇消毒，手術(shù)刀切取皮膚，置于william’s E溶液（含青霉素400 IU/mL，鏈霉素100 μg/mL）中，帶回實驗室備用。

1．2 藥品

1）對照無血清培養(yǎng)基：Williams E，胰島素10 μg/mL，氫化可的松10 ng/mL，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 μg/mL。

2）加入雌激素無血清培養(yǎng)基：Williams E、胰島素10 μg/mL，氫化可的松10 ng/mL，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，雌激素0.5μg/mL。

3）培養(yǎng)體系為5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)環(huán)境下的綿羊皮膚體外無血清漂浮式培養(yǎng)體系。

4）四孔板培養(yǎng)，皮膚大小為5 mm×5 mm。

本試驗所用試劑，除非特別聲明，均購自Sigma公司。

1.3 染色

1.3.1 HE染色 組織經(jīng)固定—脫水—透明—浸蠟—包埋后切片，切片進行HE染色，封片。

1.3.2 凋亡抗體cl-caspase3的免疫組化染色 組織經(jīng)固定—脫水—透明—浸蠟—包埋后切片，切片浸蠟、抗原修復后孵育1抗后4℃過夜，充分清洗后孵育2抗室溫30 min，然后進行DAB染色，接著蘇木素復染，用中性樹膠封片。

1.4 儀器

體視顯微鏡：型號SZX9，日本生產(chǎn)；電子天平：型號BP3100S，德國生產(chǎn)；超純水儀：MiLLi-Q，美國生產(chǎn)；高壓滅菌器：型號SS245，日本生產(chǎn)；倒置熒光顯微鏡：型號IX-71，日本生產(chǎn)；超凈工作臺：型號BCM-1000，蘇州蘇凈集團安泰公司生產(chǎn)；PH儀：型號828，美國生產(chǎn)。

2 結(jié)果

從HE染色的結(jié)果來看，新鮮皮膚毛囊成群分布，結(jié)構(gòu)清晰緊湊，毛囊外周細胞核環(huán)形分布，且分布均勻緊致，真皮結(jié)構(gòu)緊密，形態(tài)清晰。體外培養(yǎng)的皮膚與新鮮皮膚相比，其毛囊分布散亂，毛囊群結(jié)構(gòu)明顯受到了破壞，毛囊形態(tài)疏松，結(jié)構(gòu)變化，毛囊外周細胞核分布松散，有擴散現(xiàn)象，真皮結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了松散現(xiàn)象，皮膚附屬結(jié)構(gòu)的層次越來越不規(guī)則。在培養(yǎng)皮膚的結(jié)構(gòu)對比中，沒有觀察到有明顯的差異，即體外培養(yǎng)皮膚在培養(yǎng)過程中具有相同的結(jié)構(gòu)破壞的趨勢，加入雌激素對這種退行性的變化沒有可見的明顯作用。見圖1。

圖1 3個實驗組HE染色切片（a～c.100×，d～i.200×）

從免疫組化染色來看，0.5μg/mL雌激素加入培養(yǎng)體系后，毛囊出現(xiàn)了普遍的凋亡現(xiàn)象，凋亡主要出現(xiàn)在毛囊的內(nèi)外根鞘上，而毛母質(zhì)和毛乳頭部分較少細胞凋亡。同時，在雌激素的作用下，皮脂腺也出現(xiàn)了細胞凋亡且主要發(fā)生在上皮細胞。沒有加入雌激素的培養(yǎng)組其結(jié)果與新鮮皮膚的相一致，在毛囊和皮脂腺上均沒有觀察到細胞的凋亡。見圖2。

圖2 3個實驗組cl-caspase3染色切片（a～c.100×,d～g,i.200×,h.400×,＊皮脂腺，褐色為細胞凋亡）

3 討論

體外培養(yǎng)綿羊皮膚的培養(yǎng)過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)逐漸破壞的過程，這從培養(yǎng)前后的真皮層、毛囊逐漸松散無序和細胞核逐漸彌散化都可以看出來，而這種結(jié)構(gòu)的破壞解釋了體外培養(yǎng)綿羊皮膚中RNA含量逐漸降低的部分原因，因為這種松散化的結(jié)果可能是細胞間信息通路的喪失，結(jié)構(gòu)的破壞導致細胞對彼此之間和之外的信號接收能力下降，盡管作為個體而言是單個活細胞，但是因為無法啟動基因的表達，不能執(zhí)行其生物學功能，因此出現(xiàn)了培養(yǎng)皮膚的總RNA含量明顯降低的現(xiàn)象。說明維持皮膚細胞間連接和正常組織結(jié)構(gòu)需要來源于皮膚組織外的細胞因子等其他因素的參與。

從cl-caspase3染色的情況可以看出，0.5 μg/mL雌激素對體外培養(yǎng)綿羊皮膚毛囊有負面影響。這與Kondo等［6］發(fā)現(xiàn)雌激素對培養(yǎng)的人頭皮毛囊有生長抑制作用的結(jié)果相似。本實驗中這種負面作用主要是由于它引起了皮膚的附屬結(jié)構(gòu)毛囊和皮脂腺上的細胞凋亡。雌激素主要引起毛囊內(nèi)外根鞘上的細胞凋亡，在毛母質(zhì)和毛乳頭中的凋亡要少于內(nèi)外根鞘上，在皮脂腺上則是上皮細胞的凋亡。因此，推測這種凋亡現(xiàn)象與毛囊周期有很大的關系，因為Kovacs的實驗證明雌二醇會導致毛囊進入退行期［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，促乳素受體在毛囊的不同生長周期中具有顯著的表達差異。哺乳動物毛發(fā)生長的季節(jié)性原因在于促乳素的調(diào)節(jié)［7］，它導致了動物的季節(jié)性換毛［8］。但是，雌激素可能也參與了毛囊周期的調(diào)控，并有可能是調(diào)控動物季節(jié)性脫毛的一個重要因素。至于在動物毛囊周期調(diào)控中有哪些激素及其它們的具體作用，還有待進一步的研究。同時，皮脂腺在雌激素刺激下的凋亡是一個值得注意的現(xiàn)象，這可能說明雌激素對毛囊周期的調(diào)控需要皮脂腺等皮膚附屬結(jié)構(gòu)的共同參與。

雌激素對不同的細胞具有不同的生理學作用，這可能是通過對不同受體閾值的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。因為雌激素的受體廣泛存在于毛囊、表皮、毛乳頭等細胞上，但是在相同濃度下卻出現(xiàn)了不同的生理反應。

［1］Paus R，Theoharides T C，Arck P C.Neuroimmunoendocrine circuitryof the‘brainskin connection’［J］.Trends Immunol，2006，27：32-39.

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［3］Johnson E.Seasonal changes in the skin of mammals［J］.Symp Zool Soc Land，1977，39：373-404.

［4］Johnson E.Qualitative studies of hair growth in the albino rat II.The ef fects ofsexhormones［J］.J Endocrinol，1958，16：351-359.

［5］Kovacs E J，Plackett T P，Witte P L.Estrogen replacement，aging，and cell-mediated immunity after injury［J］.J Leukoc Biol，2004，76(1): 36-41.

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［7］Nixon AJ，F(xiàn)ord CA.Regulation ofprolactin receptor expression in ovine skin in relation tocirculatingprolactin and wool follicle growth status［J］. Endocrinol，2002，172（3）：605-614.

［8］Lincoln G A，Clarke I J.Characterizing a mammalian circannual pace maker［J］.Science，2006，314：1941-1944.

Effect of Estrogen on Hair Follicles in Vitro

YangHong-yuan，HongQiong-hua，Quan Guo-bo
（AcademyofYunnan Animal Husbandryand Veterinary，Kunming650224，China）

This study was investigate to effects of exogenous estrogen on sheep skin cultured in vitro.The skin was divided into three groups：fresh，control and estrogen treated.H&E and immunohistochemical staining applied to each group.The results showed that，in H&E stain，there was nodifference between 0.5 μg/mLestrogen treated and control，both with skin structure damage compared with fresh skin;in immunohistochemical stain，0.5 μg/mLestrogen initiates apoptosis in hair follicles and sebaceous glands compared with the other twogroups.

H&E staining；immunohistochemical staining；hair follicle；apoptosis

S826．3

A

2095-3887（2014）03-0030-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．009

2014-04-28

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (CARS-40-06)；云南省科技計劃項目( 2011FB131)

楊紅遠（1978-），男，碩士，助理研究員。

洪瓊花（1968-），女，研究員，碩士生導師，從事動物遺傳育種與繁殖工作。