楊紅遠,洪瓊花,權(quán)國波
(云南省畜牧獸醫(yī)科學院,昆明650224)
雌激素對體外培養(yǎng)皮膚毛囊影響的研究
楊紅遠,洪瓊花,權(quán)國波
(云南省畜牧獸醫(yī)科學院,昆明650224)
為觀察體外培養(yǎng)綿羊皮膚對外源雌激素加入后的反應,實驗對新鮮皮膚、加入雌激素后培養(yǎng)的皮膚和對照組之間通過HE和免疫組化染色的結(jié)果進行了比較。結(jié)果表明:在HE染色中,加入0.5 μg/mL雌激素組和對照組之間沒有差異,但是它們與新鮮皮膚相比均出現(xiàn)了皮膚結(jié)構(gòu)的破壞;在免疫組化染色中,加入0.5 μg/mL雌激素組皮膚毛囊和皮脂腺普遍出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象,而對照組與新鮮皮膚組則無。表明0.5 μg/mL雌激素濃度將導致皮膚毛囊及皮脂腺的凋亡。
HE染色;免疫組化染色;毛囊;凋亡
羊毛是重要的畜牧業(yè)產(chǎn)品和工業(yè)原料,羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量不僅對畜牧生產(chǎn)效率有重要影響,而且在工業(yè)上也有重要的經(jīng)濟價值。環(huán)境應激能夠明顯調(diào)節(jié)皮膚內(nèi)神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫反應[1]。毛發(fā)的生長受激素調(diào)節(jié),而這常常與個體的年齡、發(fā)育或環(huán)境的變化同步。激素指導毛囊的內(nèi)在變化,在下一個毛囊周期中使毛發(fā)類型與內(nèi)外的變化相適應。外界的刺激如季節(jié)性的繁殖活動[2]、營養(yǎng)水平都能影響毛發(fā)類型[3]。人們早就有充分的證據(jù)證明雌激素通過它分布在皮膚中的受體對皮膚的各個結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的影響,因為性腺切除小鼠促進了毛囊生長期的加快[4]。近年來的研究表明,在小鼠皮膚的局部應用雌二醇會導致毛發(fā)生長的停止,并使毛囊加速進入退行期,如果拮抗了雌激素的作用,則小鼠的毛發(fā)又進入早期生長[5]。但是,雌激素對毛囊的作用機理人們了解尚不清晰,有待進一步研究。
1.1 材料來源
本實驗所需綿羊皮膚取自昆明市易興恒公司團結(jié)鄉(xiāng)種羊場健康成年半細毛羊。剪去肩部羊毛后用碘酒、75%的乙醇消毒,手術(shù)刀切取皮膚,置于william’s E溶液(含青霉素400 IU/mL,鏈霉素100 μg/mL)中,帶回實驗室備用。
1.2 藥品
1)對照無血清培養(yǎng)基:Williams E,胰島素10 μg/mL,氫化可的松10 ng/mL,L-谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素100 IU/mL,鏈霉素100 μg/mL。
2)加入雌激素無血清培養(yǎng)基:Williams E、胰島素10 μg/mL,氫化可的松10 ng/mL,L-谷氨酰胺2mmol/L,青霉素100IU/mL,鏈霉素100μg/mL,雌激素0.5μg/mL。
3)培養(yǎng)體系為5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)環(huán)境下的綿羊皮膚體外無血清漂浮式培養(yǎng)體系。
4)四孔板培養(yǎng),皮膚大小為5 mm×5 mm。
本試驗所用試劑,除非特別聲明,均購自Sigma公司。
1.3 染色
1.3.1 HE染色 組織經(jīng)固定—脫水—透明—浸蠟—包埋后切片,切片進行HE染色,封片。
1.3.2 凋亡抗體cl-caspase3的免疫組化染色 組織經(jīng)固定—脫水—透明—浸蠟—包埋后切片,切片浸蠟、抗原修復后孵育1抗后4℃過夜,充分清洗后孵育2抗室溫30 min,然后進行DAB染色,接著蘇木素復染,用中性樹膠封片。
1.4 儀器
體視顯微鏡:型號SZX9,日本生產(chǎn);電子天平:型號BP3100S,德國生產(chǎn);超純水儀:MiLLi-Q,美國生產(chǎn);高壓滅菌器:型號SS245,日本生產(chǎn);倒置熒光顯微鏡:型號IX-71,日本生產(chǎn);超凈工作臺:型號BCM-1000,蘇州蘇凈集團安泰公司生產(chǎn);PH儀:型號828,美國生產(chǎn)。
從HE染色的結(jié)果來看,新鮮皮膚毛囊成群分布,結(jié)構(gòu)清晰緊湊,毛囊外周細胞核環(huán)形分布,且分布均勻緊致,真皮結(jié)構(gòu)緊密,形態(tài)清晰。體外培養(yǎng)的皮膚與新鮮皮膚相比,其毛囊分布散亂,毛囊群結(jié)構(gòu)明顯受到了破壞,毛囊形態(tài)疏松,結(jié)構(gòu)變化,毛囊外周細胞核分布松散,有擴散現(xiàn)象,真皮結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了松散現(xiàn)象,皮膚附屬結(jié)構(gòu)的層次越來越不規(guī)則。在培養(yǎng)皮膚的結(jié)構(gòu)對比中,沒有觀察到有明顯的差異,即體外培養(yǎng)皮膚在培養(yǎng)過程中具有相同的結(jié)構(gòu)破壞的趨勢,加入雌激素對這種退行性的變化沒有可見的明顯作用。見圖1。
圖1 3個實驗組HE染色切片(a~c.100×,d~i.200×)
從免疫組化染色來看,0.5μg/mL雌激素加入培養(yǎng)體系后,毛囊出現(xiàn)了普遍的凋亡現(xiàn)象,凋亡主要出現(xiàn)在毛囊的內(nèi)外根鞘上,而毛母質(zhì)和毛乳頭部分較少細胞凋亡。同時,在雌激素的作用下,皮脂腺也出現(xiàn)了細胞凋亡且主要發(fā)生在上皮細胞。沒有加入雌激素的培養(yǎng)組其結(jié)果與新鮮皮膚的相一致,在毛囊和皮脂腺上均沒有觀察到細胞的凋亡。見圖2。
圖2 3個實驗組cl-caspase3染色切片(a~c.100×,d~g,i.200×,h.400×,*皮脂腺,褐色為細胞凋亡)
體外培養(yǎng)綿羊皮膚的培養(yǎng)過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)逐漸破壞的過程,這從培養(yǎng)前后的真皮層、毛囊逐漸松散無序和細胞核逐漸彌散化都可以看出來,而這種結(jié)構(gòu)的破壞解釋了體外培養(yǎng)綿羊皮膚中RNA含量逐漸降低的部分原因,因為這種松散化的結(jié)果可能是細胞間信息通路的喪失,結(jié)構(gòu)的破壞導致細胞對彼此之間和之外的信號接收能力下降,盡管作為個體而言是單個活細胞,但是因為無法啟動基因的表達,不能執(zhí)行其生物學功能,因此出現(xiàn)了培養(yǎng)皮膚的總RNA含量明顯降低的現(xiàn)象。說明維持皮膚細胞間連接和正常組織結(jié)構(gòu)需要來源于皮膚組織外的細胞因子等其他因素的參與。
從cl-caspase3染色的情況可以看出,0.5 μg/mL雌激素對體外培養(yǎng)綿羊皮膚毛囊有負面影響。這與Kondo等[6]發(fā)現(xiàn)雌激素對培養(yǎng)的人頭皮毛囊有生長抑制作用的結(jié)果相似。本實驗中這種負面作用主要是由于它引起了皮膚的附屬結(jié)構(gòu)毛囊和皮脂腺上的細胞凋亡。雌激素主要引起毛囊內(nèi)外根鞘上的細胞凋亡,在毛母質(zhì)和毛乳頭中的凋亡要少于內(nèi)外根鞘上,在皮脂腺上則是上皮細胞的凋亡。因此,推測這種凋亡現(xiàn)象與毛囊周期有很大的關系,因為Kovacs的實驗證明雌二醇會導致毛囊進入退行期[5]。有研究發(fā)現(xiàn),促乳素受體在毛囊的不同生長周期中具有顯著的表達差異。哺乳動物毛發(fā)生長的季節(jié)性原因在于促乳素的調(diào)節(jié)[7],它導致了動物的季節(jié)性換毛[8]。但是,雌激素可能也參與了毛囊周期的調(diào)控,并有可能是調(diào)控動物季節(jié)性脫毛的一個重要因素。至于在動物毛囊周期調(diào)控中有哪些激素及其它們的具體作用,還有待進一步的研究。同時,皮脂腺在雌激素刺激下的凋亡是一個值得注意的現(xiàn)象,這可能說明雌激素對毛囊周期的調(diào)控需要皮脂腺等皮膚附屬結(jié)構(gòu)的共同參與。
雌激素對不同的細胞具有不同的生理學作用,這可能是通過對不同受體閾值的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。因為雌激素的受體廣泛存在于毛囊、表皮、毛乳頭等細胞上,但是在相同濃度下卻出現(xiàn)了不同的生理反應。
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Effect of Estrogen on Hair Follicles in Vitro
YangHong-yuan,HongQiong-hua,Quan Guo-bo
(AcademyofYunnan Animal Husbandryand Veterinary,Kunming650224,China)
This study was investigate to effects of exogenous estrogen on sheep skin cultured in vitro.The skin was divided into three groups:fresh,control and estrogen treated.H&E and immunohistochemical staining applied to each group.The results showed that,in H&E stain,there was nodifference between 0.5 μg/mLestrogen treated and control,both with skin structure damage compared with fresh skin;in immunohistochemical stain,0.5 μg/mLestrogen initiates apoptosis in hair follicles and sebaceous glands compared with the other twogroups.
H&E staining;immunohistochemical staining;hair follicle;apoptosis
S826.3
A
2095-3887(2014)03-0030-04
10.3969/j.issn.2095-3887.2014.03.009
2014-04-28
國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (CARS-40-06);云南省科技計劃項目( 2011FB131)
楊紅遠(1978-),男,碩士,助理研究員。
洪瓊花(1968-),女,研究員,碩士生導師,從事動物遺傳育種與繁殖工作。