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        不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響

        2014-03-02 01:39:41薛志杰曹兵海
        中國草食動物科學(xué) 2014年3期
        關(guān)鍵詞:血清

        何 陽,宋 沙,薛志杰,曹 暉,曹兵海

        (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.秦寶牧業(yè))

        不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響

        何 陽1,宋 沙1,薛志杰1,曹 暉2,曹兵海1

        (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.秦寶牧業(yè))

        試驗(yàn)以3T3-L1為模型細(xì)胞,通過研究不同品種犢牛血清對其增殖與分化的影響,為早期確定牛是否具有育肥價值提供一種新思路。選取50頭秦和犢牛、50頭安和犢牛和8頭夏洛萊雜交犢牛,頸靜脈取血制備血清。試劑盒檢測細(xì)胞增殖相對數(shù),油紅0檢測脂肪含量,用比色法測定三磷酸甘油脫氫酶(GPDH)和脂肪酸合成酶(FAS)活性。結(jié)果表明:①在細(xì)胞增殖方面,在增殖的第1天3個品種雜交牛無顯著差異(P>0.05);在增殖的第2、4、6、8天夏雜牛極顯著高于秦和牛(P<0.01),顯著高于安和牛(P>0.05),而安和牛在第2天和第6天又極顯著高于秦和牛(P<0.05);在增殖的第10天夏雜牛顯著高于秦和牛(P<0.05),而夏雜牛與安和牛、安和牛與秦和牛之間均無顯著性差異(P>0.05)。②在細(xì)胞分化方面,安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天顯著高于夏雜牛和秦和牛(P<0.05);秦和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又顯著高于夏雜牛(P<0.05),第12天沒有顯著性差異(P>0.05)。③分化第10天檢測細(xì)胞內(nèi)GPDH和FAS酶活性,安和牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH極顯著高于夏雜牛(P<0.01)和秦和牛(P<0.01),FAS活性極顯著高于夏雜牛(P<0.01),顯著高于秦和牛(P<0.05);夏雜牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH顯著高于秦和牛(P<0.05),而FAS的活性兩者間沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果顯示:牛血清品種是影響前脂肪細(xì)胞增殖與分化的因素,夏雜牛血清更有利于前脂肪細(xì)胞的增殖,而安和牛血清更有利于前脂肪細(xì)胞的分化,但作為確定牛是否具有育肥價值仍需進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞:犢牛血清;3T3-L1前脂肪細(xì)胞;增殖與分化

        建立在肉牛生長發(fā)育早期就能快速、準(zhǔn)確地檢測與評估肉牛育肥效果及牛肉品質(zhì)的方法,是提高生產(chǎn)效率、準(zhǔn)確滿足消費(fèi)者的肉質(zhì)需求、提高產(chǎn)業(yè)效益的途徑之一。為達(dá)到這一目的,已用超聲波活體測定背膘厚和眼肌面積[1],并在牛肉的大理石紋和嫩度的基因標(biāo)記[2]等技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行研發(fā)應(yīng)用。

        肌間脂肪組織是影響牛肉品質(zhì)的重要因素之一,前脂肪細(xì)胞的分化活性又是影響脂肪組織發(fā)育的決定因素,而前脂肪細(xì)胞的分化活性一般受脂肪酸合成酶(FAS)、三磷酸甘油脫氫酶(GPDH)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARS)等因素的影響[3-5]。在有關(guān)前脂肪細(xì)胞分化活性的研究中,一般將3T3-L1前脂肪細(xì)胞系作為標(biāo)準(zhǔn)模型細(xì)胞,如研究肥胖、糖尿病的模型細(xì)胞[6-7],在培養(yǎng)基中添加各種物質(zhì)用以研究脂肪合成代謝的機(jī)理[8-11],但幾乎所有研究所使用的培養(yǎng)基都含有血清,說明血清是影響前脂肪細(xì)胞分化的重要因素[12]。血清中含有細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)成分,這些成分在體外可以再造適于細(xì)胞生長、繁殖、黏附和分化的生理環(huán)境[13],決定細(xì)胞的生長效果[14]。不同品種的胎牛血清對細(xì)胞增殖有影響[12],說明牛的血清成分對前脂肪細(xì)胞分化活性的影響在品種間有差異,由此推測血清成分的活性很可能受品種遺傳性能支配,繼而影響前脂肪細(xì)胞的分化活性,從而影響牛肉中的脂肪沉積效果。如果這個推斷成立,則使用不同品種的犢牛血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)模型,就有可能鑒別各品種牛的前脂肪細(xì)胞的分化活性,從而對肉牛的牛肉品質(zhì)在生長早期做出鑒別提供另一種思路。

        為此,本試驗(yàn)采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為模型細(xì)胞,用不同品種牛血清作用于細(xì)胞,研究了不同品種犢牛血清對前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        3T3 -L1前脂肪細(xì)胞購自國家細(xì)胞資源中心。犢牛血清采自陜西秦寶牛場的108頭牛,所有牛都在5~7月齡,其中秦川牛與和牛雜交牛(秦和牛)50頭,安格斯牛與和牛雜交牛(安和牛)50頭,夏洛萊雜交牛(夏雜牛)8頭。對試驗(yàn)牛頸靜脈采血,4℃下3 000 r/min離心10 min(上海安亭),取血清于-20℃冰箱(中科美菱)保存待測。試驗(yàn)所用試劑除特殊說明以外均購于Sigma。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 血清的處理 將-20℃保存的血清放在4℃下解凍,每管中取一部分直接用0.22 μm微孔過濾器(Pall)過濾待測。

        1.2.2 前脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng) 將匯合成單層的3T3-L1細(xì)胞消化,以104細(xì)胞/mL密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。匯合2 d后換用含胰島素10 mg/L,地塞米松1 μmol/L,1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5mmol/L,10%不同牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(分化第0天),分化第2天換用含胰島素10 mg/L、10%不同牛血清的分化培養(yǎng)基,第4天以后換用含10%不同牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司),每2天換1次液。油紅0(北京經(jīng)日今典)染色法測定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量[15],用酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)在540 nm波長下的吸光度(OD值)表示脂肪含量。

        1.2.3 前脂肪細(xì)胞的增殖 將匯合成單層的3T3-L1細(xì)胞消化,以103細(xì)胞/mL密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。以后換用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(10%不同牛血清),每兩天換1次液。用CCK-8試劑盒在37℃孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測得的吸光度作為細(xì)胞相對數(shù)量。

        1.2.4 三磷酸甘油脫氫酶(GPDH)活性測定 棄去培養(yǎng)液,用PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)沖洗兩遍,加入冰蔗糖(北京廣達(dá)恒益)緩沖液1 mL/孔,用超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)破碎成勻漿30 s。將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。勻漿液在4℃,3 000 r/min離心5 min,吸取上層清液即為分析用液;測定過程參照Wise等[16]方法進(jìn)行。蛋白濃度采用考馬氏亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。1U酶活相當(dāng)于氧化1nmol的NADH/min,以此代表分化能力。

        1.2.5 脂肪酸合成酶(FAS)活性測定 在周長海等[17]測定的基礎(chǔ)上,做了如下修改。加入11.05 mmol/Lβ-NADPH溶液0.04 mL,7.25 mmol/L乙酰輔酶 A溶液0.04 mL,40℃的Cook-tail Solution緩沖溶液1.4 mL,上清液0.08 mL,混合均勻后,再加入3.51 mmol/L丙二酸單酰輔酶A溶液0.08 mL,迅速震動混合后,用紫外分光光度計(jì)(日本島津制作所)在340 nm條件下測1 min吸光度變化。蛋白濃度采用考馬氏亮藍(lán)蛋白定量試劑盒測定。1U酶活相當(dāng)于氧化1 nmol的NADPH/min,用來代表分化能力。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        本試驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。用EXCEL2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì);用SAS V9.0 for windows軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行GLM單因素方差分析,用Duncan氏法多重比較平均值之間差異的顯著性。差異性顯著水平為P<0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

        由表1可見,隨著細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)的增加,細(xì)胞數(shù)量呈“S”形增長。在增殖的第1天,3個品種雜交牛細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(P>0.05);在增殖的第2、4、6、8天夏雜牛極顯著高于秦和牛(P<0.01),顯著高于安和牛(P<0.05),而安和牛在第2天和第6天又極顯著高于秦和牛(P<0.01);在增殖的第10天夏雜牛顯著高于秦和牛(P<0.05),而夏雜牛與安和牛、安和牛與秦和牛之間均無顯著差異(P>0.05)。

        表1 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影晌

        2.2 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

        由表2可見,隨著細(xì)胞分化培養(yǎng)天數(shù)的增加,細(xì)胞內(nèi)合成脂肪的量逐漸增加。在分化前期(2 d),細(xì)胞的脂肪合成量以安和牛>秦和牛>夏雜牛的順序表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。在分化后期(10~12 d)夏雜牛的脂肪合成量大于秦和牛但小于安和牛。安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天顯著高于夏雜牛和秦

        和牛(P<0.05);秦和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又顯著高于夏雜牛(P<0.05),第12天沒有顯著性差異(P>0.05)。

        表2 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影晌

        2.3 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響

        由表3可見,由于脂肪細(xì)胞合成脂肪最快時期是第8天以后,所以在分化的第10天檢測細(xì)胞液中GPDH和FAS的活性。安和牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH活性極顯著高于夏雜牛(P<0.01)和秦和牛(P<0.01),F(xiàn)AS的活性極顯著高于夏雜牛(P<0.01),顯著高于秦和牛(P<0.05);夏雜牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH顯著高于秦和牛(P<0.05),而FAS的活性兩者間沒有顯著性差異(P>0.05)。

        表3 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響U

        3 討論

        3.1 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

        血清影響細(xì)胞的形態(tài)、生長情況、細(xì)胞傳代及凍存各方面,研究認(rèn)為不同胎牛血清對細(xì)胞增殖有影響[12]。秦安牛血清與秦川牛血清相比,秦安牛血清可能有利于細(xì)胞的增殖[18]。本試驗(yàn)中,夏雜牛血清比安和牛和秦和牛血清更有利于細(xì)胞的增殖,而安和牛血清又比秦和牛血清更有利于細(xì)胞的增殖,說明所測3個牛種犢牛血清中的某些成分具有獨(dú)自的促脂肪細(xì)胞增殖能力,其中在三磷酸甘油脫氫酶活性上,5~7月齡的夏雜牛高于其他兩種牛,而安和牛又高于秦和牛。

        3.2 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

        前脂肪細(xì)胞分化過程中的一個顯著性標(biāo)志是細(xì)胞中逐漸沉積大量的脂肪。有研究認(rèn)為,貓血清比胎牛血清更能促進(jìn)大鼠前脂肪細(xì)胞及3T3-F442A細(xì)胞的分化[19];血清能促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪的沉積[20]。馮麗萍等[18]報(bào)道,秦川牛血清比秦安牛血清可能更有利于細(xì)胞的分化。在本試驗(yàn)研究中,安和牛血清比秦和牛血清和夏雜牛血清更能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化,而秦和牛血清又比夏雜牛血清更能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化。從3T3-L1細(xì)胞模型推測,安和牛脂肪沉積要比秦和牛和夏雜牛快,秦和牛脂肪沉積又比夏雜???。張國梁等[21]的育肥結(jié)果也證實(shí)了本研究的研究結(jié)果。

        3.3 不同品種犢牛血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響

        細(xì)胞分化過程會編碼大量與脂肪合成有關(guān)的酶類,其中GPDH、FAS是分化晚期的標(biāo)志物[22],晚期標(biāo)志物活性的強(qiáng)弱表示前脂肪細(xì)胞分化活性的強(qiáng)弱,它的出現(xiàn)標(biāo)志著脂肪細(xì)胞的生長和生成。研究認(rèn)為在細(xì)胞分化過程中與脂肪合成有關(guān)的酶不僅在數(shù)量上增加,而且促進(jìn)細(xì)胞合成新的、熱穩(wěn)定的GPDH,并且GPDH的活性會上升600多倍[16]。研究認(rèn)為貓血清比胎牛血清培養(yǎng)的大鼠前脂肪細(xì)胞及3T3-F442A細(xì)胞的中GPDH和FAS活性高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞中的GPDH最高,這與細(xì)胞合成脂肪的量相符合。雖然秦和牛血清組培養(yǎng)細(xì)胞合成脂肪量比夏雜牛大,但在分化后期夏雜牛血清組合成脂肪速度比秦和牛血清組快。說明夏雜牛血清組中GPDH活性比秦和牛血清組高。在脂肪合成過程中,首先是乙酰輔酶-A經(jīng)過7次酶促反應(yīng)合成棕櫚酸,F(xiàn)AS是這7個酶促反應(yīng)的脂肪酸合成酶系[23]。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中細(xì)胞中的FAS活性升高可達(dá)19.5倍,并穩(wěn)定在12.5倍[24]。在本試驗(yàn)中,F(xiàn)AS的活性與脂肪合成量存在正相關(guān)關(guān)系,安和牛血清組的細(xì)胞中FAS及GPDH的活性最高,使得細(xì)胞中合成的脂肪量最高。

        4 結(jié)論

        夏雜牛血清比安和牛血清和秦和牛血清更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖,而安和牛血清比夏雜牛血清和秦和牛血清更能促進(jìn)細(xì)胞的分化,秦和牛血清的促增殖和分化能力介于夏雜牛血清和安和牛血清之間。但這種通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法作為確定牛是否具有育肥價值仍需進(jìn)一步研究。

        致謝:感謝在陜西秦寶采樣時,牛場所有工作人員對采樣的支持和幫助!

        [1]陳金寶,王淑輝,許尚忠,等.超聲波技術(shù)在養(yǎng)牛業(yè)上的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,10(35):144-146.

        [2]許尚忠,李俊雅,任紅艷,等.中國西門塔爾牛選育及其進(jìn)展[J].中國畜禽種業(yè),2008,4(5):13-15

        [3]Ikeda Y,Tsuchiya H,Hama S,et al.Resistin affects lipid metabolism during adipocyte maturation of 3T3-L1 cells[J].FEBS Journal,2013,280(22):5884-5895.

        [4]Ho J N,Son M E,Lim W C,et al.Germinated Brown Rice Extract In hibits Adipogenesis Through the Down-regulation ofAdipogenic Genes in 3T3-L1 Adipocytes[J].Plant foods for human nutrition,2013,68(3): 274-278.

        [5]Hsu C L,Lin Y J,Ho C T,et al.Inhibitory effects of garcinol and pterostilbene on cell proliferation and adipogenesis in 3T3-L1 cells[J]. Food&Function,2012,3(1):49-57.

        [6]Shizuka H.Mai Y,Hiroyuki K,et a1.Activin A inhibits differentiation of 3T3-L1.preadipocyte[J].Molecular and Cellular Endocrinology.2005,232:21-26

        [7]曾慧,楊智,黃瓊,等.組胺對分化的3T3L1細(xì)胞UCP2表達(dá)的影響[J].中南藥學(xué)2008,1(6):1-4

        [8]Suzuki R,Tanaka M,Takanashi M.Anthocyanidins-enriched bilberry extracts inhibit 3T3-L1 adipocyte differentiation via the insulin pathway[J].Nutrition&Metabolism,2011,8:14

        [9]Stanton L A,Maryna V,Willem O.The influence of plasma lipoprotein subfractions on 3T3-L1 and human preadipocyte differentiation in cell culture[J].Comparative Biochemistryand PhysiologyPart B120(1998)507-516

        [10]盧婷.楊靜.甘精、地特和人胰島素對3T3一L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,5(9): 545-546.

        [11]李杰梅,徐娟娟,楊得坡,等.共軛亞油酸對脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].天然無研究與開發(fā),2011,23:704-708.

        [12]吳宏梅,關(guān)偉軍,馬月輝,等.不同胎牛血清對動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,4(36):96-99

        [13]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].陜西西安:世界圖書出版社.2001.

        [14]鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京:北京出版社,1994.54-55

        [15]Ramirez-zacarias J L,Castro-mufiozledoF,Kuri-hsrcucH W.Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red OE[J].Histochem,1992,97:493-497.

        [16]Wise LS,Green H.Participation ofone isozyme ofcytosolic gl-yserohposohate dehydrogenase in the adipose conversion of 3T3 cells[J].J Biol Chem,1979,l(254):273-257.

        [17]周長海,田中桂一.肉鴨肝臟脂肪酸合成酶活性及脂肪酸合成途徑的研[J].東北師大學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2004,36(3):79-84.

        [18]馮麗萍,宋忠峰,曹兵海,等.不同品種牛血清對3T3L1前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,11(38):57-60.

        [19]李振華,黃汝多.大鼠前脂細(xì)胞和3T3-F442A細(xì)胞對貓血清因子的分子誘導(dǎo)作用的差異性反應(yīng)[J].激光生物學(xué)報(bào),2004,13(4): 241-252.

        [20]劉海峰,李學(xué)偉,王滔,等.血清對豬前脂肪細(xì)胞分化過程中聚脂相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(12):1718-1726.

        [21]張國梁,王重陽.營養(yǎng)水平對不同品種雜交肉牛育肥的影響[J].反芻動物營養(yǎng),2007(2):48-52.

        [22]Macdougal O A.Lane M D.Transcriptional regulation of gene expression during adipocyte differentiation[J].Annu Rev Bio.chem,1995,64:345-373.

        [23]Weiss G H,Rosen O M,Rubin C S,et al.Regulation of Fatty Acid Synthetase Concentration and Activity during Adipocyte Differentiation[J].Biol Chem,1980,10(255):4751-4757.

        [24]Student A K,Hsu R Y,LANE MD.Induction of fatty acid synthetase synthesis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes[J].Journal of Biological Chemistry,1980,255(10):4745-4750.

        [25]高麗南,王思珍,曹穎霞,等.營養(yǎng)與品種對肉牛血清中AMPK活性與血液生化指標(biāo)關(guān)系的研究[J].中國畜牧雜志,2012,9:009.

        S823.1

        A

        2095-3887(2014)03-0026-04

        10.3969/j.issn.2095-3887.2014.03.008

        2014-04-23

        國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38);南方地區(qū)草食家畜育肥與高品質(zhì)肉生產(chǎn)技術(shù)研究(201303144)

        何陽(1987-),碩士生。

        曹兵海,博士生導(dǎo)師,主要從事肉牛營養(yǎng)與肉品質(zhì)研究。

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