吐來(lái)力江·哈木太，安外爾·熱合曼，依明·蘇來(lái)曼，決肯·阿尼瓦什

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

阿勒泰羊羔羊MSTN mRNA表達(dá)的發(fā)育性變化

吐來(lái)力江·哈木太，安外爾·熱合曼，依明·蘇來(lái)曼，決肯·阿尼瓦什

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）是一種骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。試驗(yàn)以不同生長(zhǎng)階段的阿勒泰羊羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了肌肉和脂肪組織中MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量。比較該基因在不同月齡阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明：阿勒泰羊0～6月齡羔羊MSTN mRNA在肌肉和脂肪組織中均有表達(dá)。4月齡羔羊MSTN mRNA表達(dá)量在肌肉中最高，0～4月齡的表達(dá)量逐漸上升，4～6月齡逐漸下降。6月齡羔羊脂肪中的MSTN mRNA表達(dá)量最高。不同月齡階段阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪MSTN mRNA表達(dá)量存在差異，這些差異可能會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)肉性能等指標(biāo)，這對(duì)進(jìn)一步理解MSTN基因的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

阿勒泰羊；MSTN；肌肉；脂肪

阿勒泰羊是經(jīng)過(guò)上千年獨(dú)特自然條件選擇和哈薩克牧民長(zhǎng)期選育而成的新疆地方綿羊優(yōu)良品種，主要產(chǎn)區(qū)在新疆北部阿勒泰地區(qū)的福海、富蘊(yùn)、青河等地，分布在阿勒泰、布爾津、吉木乃及哈巴河等縣［1］。在放牧條件下，該品種羊具備生長(zhǎng)發(fā)育快、體型大、肉脂生產(chǎn)性能高、肌肉發(fā)達(dá)、羔羊生長(zhǎng)發(fā)育快且早熟等特點(diǎn)［2］。

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）也稱為生長(zhǎng)分化因子GDF-8，是TGF-β超家族中的一員［3］。研究顯示，MSTN基因除了對(duì)肌肉生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用［4］外，還可影響脂肪組織的發(fā)育，最終導(dǎo)致脂肪積累的部分抑制［5］。Luc Grobet等［6］和 Alexandra C等［7］的研究顯示，比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因編碼區(qū)末端11 bp的缺失導(dǎo)致了其肌肉過(guò)度肥大。McPherron等［5］報(bào)道MSTN基因的活性喪失可引起肌肉和體重增加，而脂肪不增加。對(duì)牛、豬、小鼠、人Myostatin基因表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育期間MSTN表達(dá)量高，在出生以后，表達(dá)水平明顯降低，但仍有少量表達(dá)。另外，Myostatin的表達(dá)主要在骨骼肌中，在脂肪組織、腦、心、小腸、腎、肝和乳腺等器官中也有表達(dá)［8-11］。吳舟等［12］采用MSTN RNAi雙元表達(dá)載體對(duì)成肌

細(xì)胞增殖和分化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雙元表達(dá)載體能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞大量增殖和成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞分化及形成肌管，從而形成大量肌纖維。李達(dá)等［13］對(duì)湖羊MSTN基因表達(dá)的發(fā)育性變化的研究結(jié)果表明，MSTN在湖羊公母羊以及各月齡間大多存在顯著或極顯著差異。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)MSTN基因的研究報(bào)道較多，這些研究大部分都集中在基因多態(tài)性方面，但針對(duì)阿勒泰羊MSTN基因表達(dá)規(guī)律的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)熒光定量PCR 2-ΔΔCt方法［14］分析0～6月齡阿勒泰羊羔羊MSTN基因在肌肉和脂肪組織中的表達(dá)差異，深入了解MSTN基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律，為以后對(duì)阿勒泰羊MSTN基因以及該品種羊產(chǎn)肉性能分子機(jī)制的研究奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 動(dòng)物 從阿勒泰羊生產(chǎn)基地選擇0～6月齡的阿勒泰羊羔羊10只。每月做手術(shù)從后腿肌肉組織和尾部脂肪組織中采集樣品，分別裝在凍存管中，迅速放入液氮罐中保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑（Trizol Reagent）、反轉(zhuǎn)錄試劑（Reverse Transcriptase M-MLVRNase H-）、熒光定量試劑（Ribonuclease Inhibitor、SYBER PremixExTaqTM）等購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）等均由公司提供。

1.1.3 儀器 DYY-6C電泳儀，NanoDrop 2000c分光光度計(jì)，PCR儀（Biometra T），JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)，Light Cycler 2.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1．2 方法

1.2.1 基因組總RNA的提取 按照Trizol試劑的說(shuō)明提取阿勒泰羊肌肉和脂肪組織總RNA，分別吸取4 μL總RNA溶液，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的總RNA質(zhì)量，同時(shí)利用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度,選出OD260/OD280比值達(dá)到1.7～2.0的RNA?？俁NA溶液迅速置于超低溫冰箱中（-80℃）保存。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 調(diào)整所提取的總RNA濃度為2 μg，反轉(zhuǎn)錄體系為25 μL：模板RNA 2.5 μg，OligodT（18）1 μL，10×dNTP 1.5 μL，加RNase Free ddH2O10 μL后在普通PCR上70℃保溫5 min后迅速冰急冷2 min以上，急冷后離心數(shù)秒加5×buffer 5 μL、inhibitor 0.1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNase Free ddH2O 9.4 μL后在PCR上42℃1 h、70℃15 min。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)各基因在GenBank中的mRNA序列，利用primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。所設(shè)計(jì)的引物由上海生物公司合成。各基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 MSTN和β-actin基因的引物序列參數(shù)

1.2.4 MSTN基因mRNA表達(dá)的定量 利用普通PCR擴(kuò)增MSTN基因，檢測(cè)引物特異性。然后對(duì)肌肉組織和脂肪組織中MSTN mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。具體反應(yīng)體系：RNase Free ddH2O 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2× SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA模板2.0 μL，共20 μL。MSTN反應(yīng)條件：95.0℃10 s（預(yù)變性）；PCR：95.0℃5 s，60.0℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃10 s；65.0～95.0℃升溫0.5℃/s（PlateRead）。β-actin反應(yīng)條件：95.0℃10 s（預(yù)變性）；95℃ 5 s，54.0℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃10 s；65.0～95℃升溫0.5℃/s（Plate Read）。以β-actin為對(duì)照，對(duì)MSTN mRNA表達(dá)水平進(jìn)行校正。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MSTN基因在不同組織的表達(dá)差異。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 先將10個(gè)個(gè)體不同階段的表達(dá)數(shù)據(jù)作為重復(fù)度量變量來(lái)對(duì)待，利用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件的重復(fù)度量線性模型進(jìn)行多元方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，從圖1中可見(jiàn)較清晰的28S、18S和5S RNA帶，其中5S帶較淺。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280比值在1.7～2.0，表明RNA純度和質(zhì)量很好，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 總RNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)

2．2 阿勒泰羊MSTN基因和β-actin基因的PCR擴(kuò)增

在阿勒泰羊肌肉組織和脂肪組織中提取總RNA后，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2%瓊脂糖凝膠分別電泳檢測(cè)MSTN基因和β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。從圖2可以

看出，可見(jiàn)引物可靠，可用于定量分析。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果（A、B分別代表MSTN、β-actin）

2.3 阿勒泰羊羔羊肌肉組織中MSTN mRNA的發(fā)育性變化

從表1可以看出，MSTN mRNA在0～6月齡阿勒泰羊羔羊肌肉組織中均有表達(dá)。其中4月齡羔羊MSTN mRNA表達(dá)量最高，0月齡羔羊的A表達(dá)量最低。4～5月齡羔羊肌肉組織中MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0～3月齡（P<0.05）及6月齡羔羊（P＜0.05）。0～2月齡羔羊肌肉MSTN表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。0～4月齡羔羊肌肉MSTN的表達(dá)量具有逐漸上升的趨勢(shì)，4～6月齡有下降趨勢(shì)。

表1 0～6月齡阿勒泰羊羔羊肌肉組織MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 阿勒泰羊羔羊脂肪組織中MSTN mRNA的發(fā)育性變化

經(jīng)過(guò)定量發(fā)現(xiàn)，MSTN mRNA在阿勒泰羊0～6月齡羔羊脂肪組織中均有表達(dá)。從表2可以看出，0～6月齡羔羊脂肪組織中MSTN mRNA表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，0月齡羔羊MSTN mRNA表達(dá)最低，6月齡羔羊最高。0～2月齡羔羊脂肪中的表達(dá)量顯著低于3～6月齡羔羊（P＜0.05）。

表2 0～6月齡阿勒泰羊羔羊脂肪組織MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用的同時(shí)，還有影響脂肪形成等作用。國(guó)內(nèi)對(duì)MSTN基因的研究主要集中在牛、豬兩種動(dòng)物身上，而且大部分集中在基因多態(tài)性方面。本試驗(yàn)通過(guò)定量0～6月齡阿勒泰羊羔羊肌肉組織和脂肪組織MSTN mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)0～6月齡現(xiàn)阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪組織中MSTN mRNA均有表達(dá)。其中4月齡羔羊MSTN mRNA表達(dá)量最高，0月齡羔羊的表達(dá)量最低；4～5月齡羔羊肌肉組織中MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0～3月齡及6月齡羔羊（P＜0.05）；0～4月齡月齡的表達(dá)量具有逐漸上升趨勢(shì)，4～6月齡表達(dá)量具有下降趨勢(shì)。0～5月齡羔羊脂肪組織中MSTN mRNA表達(dá)量具有上升趨勢(shì)，0月齡羔羊MSTN mRNA表達(dá)量最低，6月齡羔羊表達(dá)量最高；0～2月齡羔羊脂肪中的表達(dá)量顯著低于3～6月齡羔羊（P＜0.05）。Ji等［9］的研究結(jié)果表明，在豬的整個(gè)生長(zhǎng)期中，MSTN基因在骨骼肌中表達(dá)。白素英等［15］的研究顯示，MSTN基因mRNA在骨骼肌和心肌中的表達(dá)量較高，平滑肌中表達(dá)量極弱。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符。梁婧嫻等［16］報(bào)道，MSTN基因在腿肌中的表達(dá)量最高，在其他組織中幾乎未表達(dá)。胡蘭等［17］檢測(cè)大骨雞MSTN基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MSTN基因在骨骼肌中表達(dá)量水平較高，在心肌、腎臟、腦、腸、舌中也有微量表達(dá)，但在肺、肝臟中未檢測(cè)出。從這些研究結(jié)果看，MSTN基因在各組織中有不同程度的表達(dá)。

本試驗(yàn)首次對(duì)不同生長(zhǎng)階段的阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪中MSTN基因的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)在每個(gè)階段MSTN基因在肌肉和脂肪中均有不同程度的表達(dá)。這可能與MSTN基因特異性抑制肌肉生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)脂肪形成的功能有關(guān)。因此，按照MSTN基因在各階段的表達(dá)特征，利用基因切除、抗體抗原等生物學(xué)方法控制阿勒泰羊羔羊肌肉生長(zhǎng)和脂肪的形成，將有助于提高阿勒泰羊羔羊生長(zhǎng)發(fā)育、肉質(zhì)性狀和生產(chǎn)性能。

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Developmental Changes of Expression of MSTN mRNA in Altay Lambs at the Age of 0～6 Month

Tulailijiang·Hamutai，Anwaier·Reheman，Jueken·Aniwash，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

Myostatin is a negative regulater of skeletal muscle growth and development.In order to compare the expression of MSTN mRNA in the muscle and fat tissues of 0～6-month-old Altay lambs，the relative expression levels of MSTN mRNA of 10 Altaylambs were determined with the real time PCR technology.The results showed that the MSTN mRNAwere expressed both in the muscle and fat tissues；the expression level ofMSTN mRNAin the muscle ofthe lambs increased during0～4 month，decreased during 4～6 month，was the highest at 4th month;the expression level of MSTN mRNA in the fat tissue increased during 0～6 month，was the highest at 6th month.The expression differences of MSTN mRNA in the muscle and fat tissues might affected the growth and development，meat production and its quality.This study might lay a foundation for understanding the role of MSTN gene.

AltaySheep；MSTN；muscle；fat

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0015-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．004

2014-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260530）

吐來(lái)力江·哈木太（1987-），男，哈薩克族，碩士研究生。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈薩克族，教授，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。