任有蛇，白元生，楊子森，師周戈，劉曉妮，張春香

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2．山西省農(nóng)業(yè)廳生態(tài)畜牧產(chǎn)業(yè)管理站）

遺傳育種

3個(gè)綿羊群體MSTN基因編碼區(qū)PCR-SSCP分析

任有蛇1，白元生2，楊子森2，師周戈2，劉曉妮2，張春香1

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2．山西省農(nóng)業(yè)廳生態(tài)畜牧產(chǎn)業(yè)管理站）

采用PCR-SSCP技術(shù)分析了3個(gè)不同綿羊品種（杜泊綿羊、小尾寒羊、晉中綿羊）肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因的單核苷酸多態(tài)性。根據(jù)3個(gè)綿羊品種MSTN基因Exon1（P1）、Exon2（P2和P3）和Exon3（P4和P5）序列設(shè)計(jì)5對(duì)PCR-SSCP引物并擴(kuò)增，經(jīng)SSCP分析，P1位點(diǎn)檢測(cè)到A和B兩個(gè)等位基因，AA、AB、BB三種基因型；且在晉中綿羊上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而在小尾寒羊和杜泊綿羊上極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。P2和P5位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)。P3位點(diǎn)檢測(cè)到A和B兩個(gè)等位基因，AA、BB兩種基因型；且在3個(gè)綿羊品種上極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。P4位點(diǎn)檢測(cè)到A、B和C三個(gè)等位基因，AA、AB、AC三種基因型；且在小尾寒羊上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在晉中綿羊上處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，在杜泊綿羊上極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

MSTN；PCR-SSCP；等位基因；多態(tài)性

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族的成員之一，是廣泛存在于骨骼中的一種糖蛋白。McPherron等［1］首次用簡(jiǎn)并技術(shù)從小鼠肌肉組織中分離并發(fā)現(xiàn)MSTN是骨骼發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。2002年，Miranda等［2］研究發(fā)現(xiàn)在肉牛中該基因的3個(gè)外顯子上有9個(gè)影響氨基酸序列的變異，其中6個(gè)可以導(dǎo)致雙肌。引進(jìn)的“雙肌臀”型瘦肉豬的后軀表現(xiàn)出類似肉牛的雙肌現(xiàn)象。Marcq等［3］分析了比利時(shí)德克塞爾“雙肌”綿羊的可能遺傳機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與普通綿羊相比，MSTN基因的編碼

區(qū)并沒(méi)有堿基差異，于是推斷影響MSTN表達(dá)的區(qū)域可能在C端或N端的非翻譯區(qū)或內(nèi)含子部分。顧志良等［4］發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNPs位于不同品種雞MSTN基因5′和3′調(diào)控區(qū)。楊秀琴等［5］研究發(fā)現(xiàn)不同品種豬的MSTN基因5′調(diào)控區(qū)有一個(gè)T>A突變。毛亮等［6］研究獲得了具有免疫原性的牦牛MSTN成熟肽，為提高牦牛產(chǎn)肉性能提供了理論依據(jù)。李紹華等［7］研究發(fā)現(xiàn)豬MSTN基因的第2、3外顯子區(qū)域中均存在多態(tài)性位點(diǎn)。諸多研究結(jié)果表明，MSTN基因是影響肌肉發(fā)育及其相關(guān)性狀的一個(gè)重要候選基因。因此，本研究以杜泊綿羊、小尾寒羊和晉中綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其MSTN基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR-SSCP分析驗(yàn)證，篩選多態(tài)性位點(diǎn)，以期為進(jìn)一步探明MSTN基因?qū)d羊的高效選育和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、種質(zhì)資源保護(hù)與利用提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物和基因組DNA制備

3個(gè)不同品種（杜泊綿羊、小尾寒羊、晉中綿羊）綿羊各30只，采集血樣。按照常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取總DNA。

1．2 引物設(shè)計(jì)

按照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)所公布的的綿羊MSTN基因序列（DQ530260.1）上Exon1、Exon2和Exon3的序列，利用Premier 5.0軟件共設(shè)計(jì)了5對(duì)引物（見表1）。由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1．3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL，其中10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌雙蒸水13.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s（30個(gè)循環(huán)）；72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果?；厥占兓笥杀本┝先A大基因科技股份有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物序列測(cè)定驗(yàn)證。

1．4 PCR-SSCP分析

取2 μL PCR產(chǎn)物與8 μL上樣緩沖液混勻，98℃變性10 min，立即冰浴10 min，用12%聚丙烯酰胺凝膠，120V恒壓電泳5 h，染色，拍照。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析方法

1.5.1 基因頻率和基因型頻率的計(jì)算 基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率。

式中，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率；ii為純合子等位基因；ij1，ij2，……ijn為與i共顯的第1到n的等位基因。

基因型頻率指一個(gè)群體中某一基因型占所有基因型的比率。

基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定的個(gè)體數(shù)

1.5.2 群體Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)的檢驗(yàn) 用卡方檢驗(yàn)的適合性檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。當(dāng)df=1或理論次數(shù)小于5時(shí)，應(yīng)采用矯正公式。

式中：Oi為實(shí)際觀察值；Ei為理論值；n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度和純度，OD260/OD280均在1.8左右。由圖1可見，各引物PCR擴(kuò)增大小與預(yù)期結(jié)果一致，擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．2 PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

從圖2可知，P1位點(diǎn)出現(xiàn)A、B兩個(gè)等位基因，AA、BB和AB三種基因型。由圖3可知，P3位點(diǎn)共檢測(cè)到A、B兩個(gè)等位基因，AA、BB兩種基因型。由圖4可知，P4位點(diǎn)共檢測(cè)到A、B、C三個(gè)等位基因，AA、AB和AC三種基因型。而P2和P5位點(diǎn)并沒(méi)有檢測(cè)到多態(tài)結(jié)果。

圖2 引物P1的PCR-SSCP結(jié)果

圖3 引物P3的PCR-SSCP結(jié)果

圖4 引物P4的PCR-SSCP結(jié)果

2．3 MSTN基因不同位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率

對(duì)3個(gè)綿羊品種的MSTN基因P1多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)，共檢測(cè)到A、B兩個(gè)等位基因和AA、BB、AB三種基因型。由表2可見，在杜泊綿羊中，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，頻率為0.616 7；晉中綿羊和小尾寒羊中A和B等位基因頻率基本相似。就基因型分布來(lái)看，AA型在杜泊綿羊中的頻率較高為0.500 0，BB型在晉中綿羊中的頻率較高為0.500 0，AB型在小尾寒羊中的頻率較高為0.466 7?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，在P1位點(diǎn)晉中綿羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而在小尾寒羊和杜泊綿羊上極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

對(duì)3個(gè)品種綿羊的MSTN基因P3多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)，共檢測(cè)到A、B兩個(gè)等位基因和AA、BB兩種基因型。其基因型頻率和等位基因頻率的分布見表3。由表3可見，在晉中綿羊和杜泊綿羊中A等位基因占優(yōu)勢(shì)，其等位基因頻率分別為0.633 3和0.700 0。B等位基因在小尾寒羊群體上的頻率高于晉中綿羊和杜泊綿羊?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，在P3位點(diǎn)3個(gè)綿羊品種極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 不同MSTN基因P1位點(diǎn)的PCR-SSCP基因型頻率和基因頻率分布

表3 不同MSTN基因P3位點(diǎn)的PCR-SSCP基因型頻率和基因頻率分布

對(duì)3個(gè)綿羊品種的MSTN基因P4多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)，共檢測(cè)到A、B、C三個(gè)等位基因，AA、AB和AC三種基因型。由表4可見，在晉中綿羊、小尾寒羊和杜泊綿羊3個(gè)品種中，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，尤其在小尾寒羊中頻率為0.833 3。B等位基因在晉中綿羊和杜泊綿羊中頻率相似。C等位基因在杜泊綿羊中的頻率較其他兩種綿羊要高。就基因型分布來(lái)看，AA型在小尾寒羊中的頻率較高，而在杜泊綿羊中頻率較低，僅為0.100 0。卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明：在P4位點(diǎn)小尾寒羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，晉中綿羊處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，杜泊綿羊極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表4 不同MSTN基因P4位點(diǎn)的PCR-SSCP基因型頻率和基因頻率分布

3 討論

MSTN是肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育負(fù)向調(diào)控因子，是畜禽肉質(zhì)性狀的主要標(biāo)記基因。張曉強(qiáng)等［8］對(duì)晉中綿羊、小尾寒羊和杜泊綿羊3個(gè)綿羊品種的MSTN基因進(jìn)行克隆測(cè)序，在編碼序列上共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，其中杜泊羊MSTN第235（H→R）和251（S→F）位點(diǎn)氨基酸突變，小尾寒羊MSTN第343（T→A）突變，以及在晉中綿羊第282（C→R）氨基酸的突變。本研究是在這4個(gè)點(diǎn)突變基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證這些突變，分析其基因型頻率，以期發(fā)現(xiàn)與肉用性能相關(guān)的突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示3個(gè)綿羊品種P1位點(diǎn)（外顯子1）有3種不同基因型AA、AB、BB，杜泊綿羊極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，AA基因型可能與杜泊羊肥育性能和肉品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)相關(guān)。張慧玲等［9］在研究德國(guó)肉用美利奴綿羊MSTN基因外顯子1時(shí)發(fā)現(xiàn)2種不同基因型GG和GA，該G位點(diǎn)可能與肉用性能相關(guān)。劉錚鑄等［10］采用限制性內(nèi)切核酸酶山羊MSTN基因的外顯子3檢測(cè)到3種基因型。Zhang等［11］用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)了安徽白山羊和波爾山羊MSTN基因外顯子1上突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變可能與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。本研究的引物P4位點(diǎn)也在外顯子3，檢測(cè)到A、B和C三個(gè)等位基因和AA、AB、AC三種基因型；杜泊綿羊AC基因型頻率顯著高于小尾寒羊，杜泊綿羊群體中等位基因C頻率顯著高于其他兩個(gè)群體。這說(shuō)明在綿羊MSTN外顯子3上可能存在與肉用性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，但需進(jìn)一步與性狀關(guān)聯(lián)分析，找到與生長(zhǎng)發(fā)育和肉用性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

杜泊綿羊Exon1上P1片段多態(tài)位點(diǎn)和Exon3上P4片段多態(tài)位點(diǎn)可能與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

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《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》雙月刊

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》是由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部主管、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國(guó)家級(jí)科技核心期刊。于2012年4月由《中國(guó)草食動(dòng)物》更名而成?！吨袊?guó)草食動(dòng)物科學(xué)》為美國(guó)《化學(xué)文摘》（CA）收錄期刊，中國(guó)科技核心期刊，中國(guó)農(nóng)業(yè)核心期刊，RCCSE中國(guó)核心（擴(kuò)展板）學(xué)術(shù)期刊；是中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)（CSCD）、中國(guó)科技論文與引文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)（CAJCED）和中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)源期刊。

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《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》為雙月刊，大16開，80頁(yè)碼，彩色封面，每期定價(jià)8．00元，全年48．00元，雙月1日出版。國(guó)內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)：CN 62-1206/Q，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)：ISSN 2095-3887,郵發(fā)代號(hào):54—57,國(guó)外代號(hào):BM5133。全國(guó)郵局和本刊編輯部均可訂閱。

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PCR-SSCP Analysis on MSTN Gene in the Coding Region of Three Sheep Breeds

Ren You-she1，Bai Yuan-sheng2，ZhangChun-xiang1，et al
（1.College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi Bureau ofAnimal Husbandryand Veterinary）

The single nucleotide polymorphisms of myostatin（MSTN）gene in the three sheep breeds（Dorper sheep，Small-tailed Han Sheep and Jinzhong sheep）were analysed in this paper.According to the sequences of Exon1（P1），Exon2（P2 and P3），Exon3（P4 and P5）ofMSTN gene in the sheeps，5 pairs ofPCR-SSCP primers were designed and amplified byPCR-SSCP，The results showed that there were 2 alleles and AA,AB and BB genotypes in P1.the P1 loci in Jinzhong sheep were consistent with the Hardy-Weinbergequilibriumand in the Small Tailed Han sheep and Dorper sheep were significantlydeviated fromit（P＜0.01）. Polymorphism was not detected in P2 and P5.There were 2 alleles and AA and AB genotypes in P3,and three sheep breeds were significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium（P＜0.01）.There were 3 alleles and AA，AB，and AC genotypes in P4.the P4 loci in the Small Tailed Han sheep were consistent with the Hardy-Weinbergequilibrium，in Jinzhongsheep not，and in Dorper sheep significantlydeviated fromit（P＜0.01）.

MSTN；PCR-SSCP；allele；polymorphism

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0005-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．001

2014-04-29

山西省肉羊聯(lián)合育種科技合作項(xiàng)目

任有蛇(1970-)，男，副教授，博士。

張春香（1972-），女，副教授，博士，主要從事羊遺傳育種與繁殖研究。