陳耿廷，黃東燕，黃俊生

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州 521041）

超臨界CO2萃取白簕葉總黃酮工藝的研究

陳耿廷，黃東燕，黃俊生*

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州 521041）

采用超臨界CO2萃取白簕葉中的總黃酮化合物，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究了超臨界萃取條件（壓力、溫度、時(shí)間、CO2流量）對(duì)其總黃酮的影響．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取條件：萃取壓力20 MPa，萃取溫度35℃，萃取時(shí)間1 h，CO2流量20 L/h．白簕葉總黃酮提取值為2.929 mg/g.

超臨界萃??；總黃酮；白簕；正交試驗(yàn)

白簕（Acanthopanax trifoliatus（L．）Merr．），又稱苦刺、三加皮、鵝掌、三葉五加，為五加科（Araliaceae）攀援狀灌木，白簕全株均可入藥，味苦、辛、涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、舒筋、止咳平喘之功效．主要分布于我國(guó)華南、西南、華中等地區(qū)，印度東北至印度支那、日本和菲律賓也有分布，生于林緣、灌叢或山坡上[1-3].黃酮類化合物具有多種生物活性，主要表現(xiàn)為清除自由基、抗癌作用、抗突變作用、免疫增強(qiáng)等作用[3]，而白簕葉的黃酮含量較為可觀，如何充分利用這一資源大量制備生物活性黃酮將會(huì)具有十分重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義.

目前提取植物類黃酮，主要采用醇類萃取技術(shù)．筆者以白簕葉為材料，采用CO2超臨界萃取技術(shù)[4-5]，進(jìn)行了提取嘗試，以期為工業(yè)大量生產(chǎn)的技術(shù)改進(jìn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白簕（采自韓山師范學(xué)院）；蘆?。徽麴s水；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為分析純．

1.2 儀器與設(shè)備

HA120-50-01超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；LGJ-10B冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；Spectrumlabt722sp可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠）；FA2004N電子天平；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DGG-9070BD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JF?SD-100-Ⅱ粉碎機(jī)（上海嘉定糧油儀器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將自然陰干的白簕葉粉碎，過(guò)40目篩，置于錐形瓶中，加入石油醚（2 mL/g）脫脂、脫色2 h，重復(fù)幾次，至石油醚層幾乎無(wú)色，傾去浸提液，樣品置于通風(fēng)處干燥備用.

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立

1.3.2 .1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取蘆丁20.00 mg，用95%乙醇，于37℃水浴中加熱使之溶解，并定容至100 mL，即可制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，每1.0 mL溶液中含有蘆丁0.2 mg.

1.3.2 .2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL轉(zhuǎn)移至編號(hào)為0、1、2、3、4、5、6的25 mL的容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.5 mL搖勻，靜置5 min后再往各容量瓶中加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL搖勻后，靜置5 min后加入4%NaOH溶液5 mL，用95%的乙醇溶液定容至25 mL搖勻，靜置15 min，然后用紫外-可見分光光度法，在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=10.913C+0.0025，r2=0.9995．式中：C——蘆丁濃度（mg/mL），A——吸光度，表明在0.008-0.04 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好.

圖 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 提取方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取5.00 g白簕葉干燥粉末，置于萃取釜中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的工藝條件，加入一定量的夾帶劑，設(shè)定萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO2流量，進(jìn)行超臨界CO2提?。占腿∫翰y(cè)定其中黃酮的含量．

采用單因素試驗(yàn)，分別考察萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO2流量四個(gè)因素對(duì)白簕葉總黃酮提取量的影響．并設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，通過(guò)極差分析與方差分析，確定超臨界流體萃取白簕葉總黃酮的最佳條件.

1.3.4 提取物中黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定白簕葉提取物中黃酮的含量．各提取物用95%乙醇定容于50 mL容量瓶中，精密吸取其中5 mL置于50 mL容量瓶中．按標(biāo)注曲線繪制方法對(duì)樣品溶液進(jìn)行處理，測(cè)得各樣品溶液的吸光度后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各溶液中黃酮的含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2萃取白簕葉總黃酮中各種操作參數(shù)的影響

2.1.1 壓力對(duì)總黃酮提取效果的影響

取白簕葉粉末5.00 g，分別以不同的萃取壓力（15、20、25、30、35 MPa）各自在萃取溫度35℃、夾帶劑無(wú)水乙醇35 mL、CO2流速20 L/h的條件下萃取1 h，分析測(cè)定總黃酮提取量．隨著萃取壓力的增大，總黃酮提取量呈不斷增加的趨勢(shì)．當(dāng)壓力為20 MPa時(shí)，提取量達(dá)到最大．之后隨著壓力的增加，總黃酮提取量逐漸降低．這是因?yàn)殡S著壓力的升高，超臨界CO2流體的密度逐漸增加，溶質(zhì)與溶劑之間的傳遞效率增加，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)更容易傳遞到細(xì)胞的表面，使萃取更完全[6]．但當(dāng)壓力達(dá)到20 MPa后，隨著壓力的增大，原料粉末壓縮得更緊密，總黃酮溶出受阻，導(dǎo)致提取量下降．試驗(yàn)結(jié)果表明，萃取壓力為20 MPa時(shí)總黃酮提取量最大.

圖 2 壓力對(duì)白簕葉總黃酮提取量的影響

2.1.2 溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響

取白簕葉粉末5.00 g，分別以不同的萃取溫度（32、35、40、45、50℃）各自在萃取壓力20 MPa、夾帶劑無(wú)水乙醇35 mL、CO2流量20 L/h的條件下萃取1 h，分析測(cè)定總黃酮提取量．萃取溫度對(duì)提取效果具有雙重的影響．溫度升高有利于溶質(zhì)揮發(fā)性的增大，提高物料的擴(kuò)散系數(shù)，有利于黃酮類化合物的浸出．但同時(shí)又會(huì)降低CO2的濃度，減少CO2的密度，致使溶解能力的降低，對(duì)提取不利[7]．?dāng)?shù)據(jù)分析表明，萃取溫度32℃升到35℃，總黃酮提取量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)．當(dāng)溫度到達(dá)35℃時(shí)，黃酮提取量最大．導(dǎo)致溫度高于35℃時(shí)，超臨界發(fā)生了變化，黃酮類物質(zhì)含量有所下降[8-9].

圖 3 溫度對(duì)白簕葉總黃酮提取量的影響

2.1.3 時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響

取白簕葉粉末5.00 g，分別以不同的萃取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）各自在萃取壓力20 MPa、萃取溫度35℃、夾帶劑無(wú)水乙醇35 mL、CO2流量20 L/h的條件下萃取，分析測(cè)定總黃酮提取量．分析數(shù)據(jù)可知，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取所得的總黃酮增多．萃取1 h后，總黃酮的提取量無(wú)明顯的增大．考慮到隨著萃取時(shí)間的增加，超臨界萃取的能耗增大．故后續(xù)試驗(yàn)的萃取時(shí)間取為1 h.

圖 4 時(shí)間對(duì)白簕葉總黃酮提取量的影響

2.1.4 CO2流量對(duì)總黃酮提取效果的影響

取白簕葉粉末5.00 g，分別以不同的CO2流量（10、15、20、25、30 L/h）各自在萃取壓力20 MPa、萃取溫度35℃、夾帶劑無(wú)水乙醇35 mL的條件下萃取1 h，分析測(cè)定總黃酮提取量．CO2流量影響總黃酮的提取．CO2流量愈大，萃取的速率愈快；CO2流量愈小，萃取的速率愈慢．從圖5可見，CO2流量從10 L/h增加到20 L/h，總黃酮提取量明顯增加．但當(dāng)超過(guò)20 L/h以后，提取量稍有降低．這可能是因?yàn)榱髁窟^(guò)大，物料與流體的接觸不充分，不利于分離器中萃取物與CO2的分離．采用CO2流量為20 L/h最佳．

圖 5 CO2流量對(duì)白簕葉總黃酮提取量的影響

2.2 超臨界CO2萃取白簕葉總黃酮的正交試驗(yàn)分析

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以提取的黃酮總量為指標(biāo)來(lái)確定最佳提取條件．各因素及水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2.

從直觀和方差分析（見表3）可知，四種因素影響的主次是：萃取時(shí)間＞萃取溫度＞萃取壓力＞CO2流量．提取白簕葉總黃酮的最佳工藝為A2B2C2D2，即以5 g白簕葉在萃取壓力為20 MPa、萃取溫度為35℃、CO2流量為20 L/h的條件下萃取1 h.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用極差分析確定的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到白簕葉總黃酮的平均提取量為2.929 mg/g．高于正交試驗(yàn)中所有組合的提取率，證明其確實(shí)為超臨界提取白簕葉總黃酮的最佳條件.

3 結(jié)論

（1）目前，采用超臨界二氧化碳萃取對(duì)白簕葉中總黃酮的提取研究未見報(bào)道．本文采用超臨界二氧化碳萃取萃取白簕葉中的總黃酮．通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)確定了提取的最佳工藝條件．方差分析表明，最佳的提取條件為：萃取壓力20 MPa，萃取溫度35℃，萃取時(shí)間1 h，CO2流量為20 L/h，白簕葉總黃酮提取值為2.929 mg/g．

（2）各因素對(duì)總黃酮提取量的影響程度為萃取時(shí)間＞萃取溫度＞萃取壓力＞CO2流量．萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)總黃酮的提取影響較為顯著．

（3）本實(shí)驗(yàn)所采用的超臨界流體萃取技術(shù)，萃取速度快，提取效率高，流程簡(jiǎn)單，對(duì)提高野生白簕葉黃酮的利用具有一定的參考價(jià)值．

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Extraction Technology of Total Flavonoids in Acanthopanan Trifoliatus Merr by Supercritical Carbon Dioxide

CHEN Geng-ting,HUANG Dong-yan,HUANG Jun-sheng
（Department of Chemistry,Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong,521041）

Using supercritical CO2extraction of general flavone compounds in the leaves of Acantho?panax trifoliatus,by single factor test and orthogonal test,the supercritical extraction conditions(pressure,tem?perature,time and CO2flow rate)of the effects of general flavone are studied.The experimental results show that the optimum extraction conditions:20 MPa extraction pressure,extraction temperature 35℃,1 hour ex?traction time,CO2flow 20 l/h.Validation experiments show that the flavonoids extraction in Acanthopanax trifo?liatus leaves as:2.940 mg/g,to prove that the conditions for the optimum extraction conditions.

supercritical fluid extraction；general flavone；the leaves of Acanthopanan trifoliatus Merr；orthogonal test

TQ041

A

1007-6883（2014）06-0069-06

責(zé)任編輯 朱本華

2014-06-11

陳耿廷（1991-），男，廣東普寧人，韓山師范學(xué)院化學(xué)系2010級(jí)在讀學(xué)生．黃俊生為通訊作者．