阮正祥，龍冬梅，劉 君，何雪鋒，劉 江，王蕓華，李 竹，楊挺軍，陳興忠，邱聲邦，龍厚怡，錢德興

（1.貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，畢節(jié)551700；2.貴州省威寧縣動物疫控中心；3.貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)動物疫控中心；4.貴州省大方縣動物疫控中心；5.貴州省動物疫控中心）

疾病防控

山羊球蟲病流行病學(xué)調(diào)查及應(yīng)用電腦技術(shù)鑒別蟲種

阮正祥1，龍冬梅1，劉 君1，何雪鋒1，劉 江1，王蕓華1，李 竹1，楊挺軍1，陳興忠2，邱聲邦3，龍厚怡4，錢德興5

（1.貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，畢節(jié)551700；2.貴州省威寧縣動物疫控中心；3.貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)動物疫控中心；4.貴州省大方縣動物疫控中心；5.貴州省動物疫控中心）

采用飽和鹽水漂浮法、麥克馬斯特氏法、卵囊培養(yǎng)等方法及應(yīng)用電腦和配置有彩色數(shù)碼攝像機的雙目光學(xué)顯微鏡設(shè)備，在畢節(jié)市8個縣（區(qū)）、24個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、26個養(yǎng)殖戶（場）開展了山羊球蟲病流行病學(xué)調(diào)查，對339只山羊糞樣進行了定性、定量檢查和胞子化培養(yǎng)，并應(yīng)用電腦技術(shù)對山羊球蟲的卵囊種類進行了鑒別。結(jié)果顯示，球蟲卵囊的感染率96.75%；OPG值在100～472 700枚之間，平均OPG值為8 570枚，鑒別出艾美耳屬球蟲8種，并對其卵囊的形態(tài)學(xué)特征進行了詳細地描述。調(diào)查結(jié)果基本反映了當(dāng)?shù)厣窖蚯蛳x的感染狀況，表明了在電腦上直接觀察、記錄和測量球蟲卵囊的方法比在顯微鏡下方便，測量也較為準確。

球蟲；種類；調(diào)查；電腦技術(shù)

畢節(jié)市畜牧養(yǎng)殖業(yè)資源十分豐富，是貴州省畜牧生產(chǎn)大區(qū)，草食畜牧業(yè)一直處于全省領(lǐng)先地位，特別是1988年6月國務(wù)院批準建立畢節(jié)地區(qū)“開發(fā)扶貧、生態(tài)建設(shè)試驗區(qū)”及國家西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實施，為畢節(jié)市經(jīng)濟騰飛和社會發(fā)展提供了千載難逢的歷史機遇，畢節(jié)市草地資源逐步得到有效利用，草食畜牧業(yè)穩(wěn)步發(fā)展。但是由于動物疫病的困擾對畢節(jié)市草食畜牧業(yè)穩(wěn)步發(fā)展造成了一定的影響，特別是山羊球蟲病在本市早已普遍存在，而畢節(jié)市山羊球蟲病的調(diào)查工作基本處于空白，加之貴州省至今尚未見有相關(guān)山羊種類調(diào)查的報道，所以，防治資料缺乏，對該病一直處于盲目防治狀態(tài)。為摸清畢節(jié)市山羊球蟲的感染種類、分布和流行情況，有效地防治山羊球蟲病，促進養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，筆者在進行探索應(yīng)用電腦技術(shù)測量球蟲卵囊的基礎(chǔ)上［1］，于2012年8月—2013年12月在畢節(jié)市的8個縣（區(qū)）、24個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、26個養(yǎng)殖戶/場（20/6）進行了山羊球蟲病的流行病學(xué)調(diào)查，并應(yīng)用電腦技術(shù)對山羊球蟲的卵囊種類進行了鑒別，以期為山羊球蟲病的防控提供參考依據(jù)。1自然條件與草食畜牧業(yè)概況

畢節(jié)市位于貴州省西北部，地處滇東高原向黔中山原丘陵過渡的傾斜地帶，下轄7縣1區(qū)1管理區(qū)。境內(nèi)最

高海拔2 900.6 m，最低457 m，平均1 600 m。全市年均氣溫12～15.4℃，年均日照時數(shù)995.2～1 631.6 h，年均降水量727.3～1 193.2 mm；冬無嚴寒，夏無酷暑，立體氣候突出，適宜多種病源微生物的生長和繁殖。

本市草食畜牧業(yè)資源豐富，草山草坡廣闊，有牛、馬、山羊、鵝、兔等草食動物，其中2013年全市山羊存欄數(shù)91.15萬只，出欄數(shù)47.65萬只。山羊主要以放牧加補飼的方式飼養(yǎng)。

2 材料與方法

2.1 實驗器材及試劑

雙目光學(xué)顯微鏡（XSN-H），專用配置雙目光學(xué)顯微鏡的彩色數(shù)碼攝像機（SCC-101AP，天津三星電子有限公司生產(chǎn)，與電腦聯(lián)接），電腦，電視/視頻實時采集卡1張（裝入電腦主機），所有試劑有載玻片、蓋玻片、小培養(yǎng)皿、離心機、顯微鏡二維測量軟件CF-200C（上海長方光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，裝入電腦主機））、顯微鏡二維測量軟件配帶的通用定標(biāo)尺（用于確定圖像尺寸與真實尺寸的比例）、麥氏蟲卵計數(shù)板（四川省畜牧科學(xué)研究院生產(chǎn)），GPS衛(wèi)星定位儀（Oregon550）等。所用試劑有飽和鹽水溶液、飼和蔗糖溶液。

2.2 糞檢材料

從畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)、大方縣、黔西縣、金沙縣、織金縣、納雍縣、威寧縣、赫章縣等8縣區(qū)，24個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，26個養(yǎng)殖戶/場（20/6）飼養(yǎng)的8 845只山羊中，隨機直腸采集糞便樣品339只份，每戶/場采樣時均用GPS衛(wèi)星定位儀測量經(jīng)緯度和海拔高度，每只山羊采集糞樣10～30 g，并詳細登記、逐份編號裝入PE塑料自封袋，置4℃冰箱保存待檢。

2.3 卵囊定性檢查［2］

用飽和鹽水漂浮法將采集的339份糞樣逐份檢查，計算出陽染率。

2.4 卵囊定量檢查［2］

對定性檢查中呈陽性的328份糞樣，用麥氏蟲卵計數(shù)法逐份檢查，計算出每份樣品中每克糞便所含卵囊數(shù)（OPG），再通過OPG值判定感染程度，其判定標(biāo)準［1］：?OPG>10×104，為嚴重感染；?10×104≥OPG≥1×104，為中度感染；?OPG<1×104，為輕度感染。

2.5 卵囊的收集與培養(yǎng)

取定量檢查中OPG值較高的糞樣30份，逐份加水搗碎、篩濾、離心沉淀后，向沉淀物加飽和蔗糖溶液漂浮，取漂浮液離心洗去飽和糖水，收集卵囊。將收集到的卵囊移入裝有2.5%的重鉻酸鉀液的培養(yǎng)皿中，置26～28℃溫箱中培養(yǎng)至孢子化。

2.6 卵囊的鑒別與測量

根據(jù)本文參考文獻資料報道的方法和描述作出鑒別。鑒別時在10×40顯微鏡下將完全孢子化的卵囊形態(tài)，通過彩色數(shù)碼攝像機，導(dǎo)入裝置在電腦上的顯微鏡二維測量軟件中，在電腦上觀察和記錄卵囊形態(tài)，測量卵囊的大?。y量時只需將鼠標(biāo)拉黑所要測量的部位，電腦即可自動顯示所測部位實際大小的數(shù)據(jù)，見圖1～9），并在電腦上擷取球蟲卵囊顯微彩色照片。

3 結(jié)果

3.1 卵囊定性檢查結(jié)果

用飽和鹽水漂浮法定性檢查糞樣339份，檢出球蟲卵囊陽性的有328份，陽性率為96.75%（見表1）。

表1 山羊球蟲卵囊定性檢查

3.2 卵囊定量檢查結(jié)果

用麥克馬斯特氏計數(shù)法對328份糞樣逐份進行定量檢查，結(jié)果顯示：328只山羊糞樣的OPG值在100～472 700枚之間，平均每只羊的OPG值8 570枚；其中OPG值在130 000～472 700枚之間的有2只（為嚴重感染)，在10 000～55 300枚之間的有69只（為中度感染），在100～9 900枚之間的有257只（為輕度感染）［2］。

3.3 卵囊鑒別結(jié)果

孢子化卵囊鑒別出艾美耳屬球蟲8種，分別是克氏艾美耳球蟲（Eimeria christenseni）、阿氏艾美耳球蟲（E. arloingi）、柯雅艾美耳球蟲（E.ninakohlyakimovae）、艾麗艾美耳球蟲（E.alijevi）、約奇艾美耳球蟲（E.jolchijevi）、阿普艾美耳球蟲（E.apsheronica）、山羊艾美耳球蟲（E. caprina）、家山羊艾美耳球蟲（E.hirci），其感染率分別為 16.67%、80.00%、56.67%、63.33%、46.67%、60.00%、66.67%和73.33%；8種球蟲多為混合感染，其中有43.33%的糞樣含有5～7種，53.33%的糞樣含有2～4種，3.33%的糞樣含有1種?，F(xiàn)將各種卵囊形態(tài)描述如下：

阿氏艾美耳球蟲（Eimeria arloingi）（圖1-1）：卵囊呈橢圓形或卵圓形，兩側(cè)近平行，據(jù)對83個卵囊的測量，大小為30.70（26.11～36.42）μm×21.11（18.38～26.95）μm，平均形狀指數(shù)1.45；囊壁兩層，外層光滑，淡綠黃色，厚1.10 μm，內(nèi)層棕黃色，厚0.55 μm，壁內(nèi)襯有一層薄膜，呈褐色；極帽淡黃色或無色，寬高為7.31（6.12～9.20）μm× 1.84（1.29～2.76）μm；有卵膜孔，孔邊緣有皺褶；有極粒，

無卵囊殘體。孢子囊呈長卵圓形，大小為13.73（11.03～17.19）μm×7.16（5.51～9.47）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；有斯氏體，孢子囊殘體呈小顆粒狀，分布于子孢子之間。

阿普艾美耳球蟲（E.apsheronica）（圖1-2）：卵囊呈卵圓形，據(jù)對20個卵囊的測量，大小為31.94（27.04～38.07）μm×23.82（20.23～27.40）μm，平均形狀指數(shù)1.34；囊壁兩層，外層光滑，黃綠色或綠色，厚0.73 μm，內(nèi)層棕黃色或棕紅色，厚0.55 μm；無極帽，卵膜孔較小，位于卵囊窄端，孔邊緣有皺褶，有的卵囊，卵膜孔可見有一小栓塞；有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈長卵圓形，大小為14.69（12.41～17.21）μm×8.75（7.35～9.64）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；無斯氏體，孢子囊殘體由小顆粒組成，分布于子孢子之間。

柯雅艾美耳球蟲（E.ninakohlyakimovae）（圖1-3）：卵囊呈橢圓形或亞球形，據(jù)對33個卵囊的測量，大小為24.56（18.38～30.16）μm×19.96（15.93～24.09）μm，平均形狀指數(shù)1.23；囊壁雙層，外層光滑，淡綠色或淡藍色，厚0.74 μm，內(nèi)層棕黃色或棕紅色厚0.55 μm；無極帽，卵膜孔不明顯，孔邊緣有皺褶；有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈卵圓形，大小為11.58（9.12～14.50）μm×7.08（6.13～8.81）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；有斯氏體，孢子囊殘體由小顆粒組成，分布于子孢子之間。

家山羊艾美耳球蟲（E.hirci）（圖1-4）：卵囊呈短橢圓形或亞球形，據(jù)對31個卵囊的測量，大小為26.50（22.05～32.47）μm×21.68（17.77～25.23）μm，平均形狀指數(shù)1.25；囊壁兩層，外層光滑，淡黃綠色，厚0.86 μm，內(nèi)層棕黃色，厚0.50 μm；極帽淡黃色或無色，寬高為5.76（3.86～7.17）μm×1.40（1.10～2.40）μm；有卵膜孔，有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈寬卵圓形，大小為11.00（9.56～15.93）μm×7.60（6.13～8.88）μm，子孢子橫向排列于孢子囊中；斯氏較小，孢子囊殘體由小顆粒組成，分布于子孢子之間。

艾麗艾美耳球蟲（E.alijevi）（圖1-5）：卵囊呈亞球形或球形，據(jù)對30個卵囊的測量，大小為20.96（15.26～25.73）μm×19.08（12.32～23.54）μm，平均形狀指數(shù)1.10；囊壁兩層，外層光滑，淡藍色或綠色，厚0.98 μm內(nèi)層棕黃色或褐色，厚0.55 μm；無極帽，無卵膜孔，有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈長卵圓形，大小為9.90（8.25～12.69）μm×6.51（5.21～7.74）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；有斯氏體，孢子囊殘體呈小顆粒狀，分布于子孢子之間。

克氏艾美耳球蟲（E.christenseni）（圖1-6）：卵囊呈卵圓形，據(jù)對34個卵囊的測量，大小為41.45（36.71～44.75）μm×26.96（26.151～30.20）μm，平均形狀指數(shù)1.50；囊壁兩層，外層光滑，淡綠色或黃綠色，厚1.10 μm，內(nèi)層棕黃色或棕紅色厚0.74 μm，壁內(nèi)襯有一層薄膜，呈褐色；極帽淡黃色或無色，寬高為6.77（4.9～7.55）μm× 1.96（1.66～2.21）μm；有卵膜孔，孔邊緣有皺褶；有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈寬卵圓形，大小為14.38（12.86～16.09）μm×9.58（8.57～12.07）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；有斯氏體，有時不明顯，孢子囊殘體呈小顆粒狀，分布于子孢子之間。

約奇艾美耳球蟲（E.jolchijevi）（圖1-7）：卵囊呈壺形或罐形，據(jù)對27個卵囊的測量，大小為30.63（26.90～37.86）μm×22.22（16.61.～26.15）μm，平均形狀指數(shù)1.38；囊壁兩層，外層光滑，淡黃綠色或淡綠色，厚0.92μm，內(nèi)層棕黃色或棕紅色，厚0.55 μm；極帽淡黃色或無色，位于卵囊的寬端，寬高為7.45（5.57～9.01）μm× 1.30（1.10～1.83）μm；有卵膜孔、有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈卵圓形，大小為11.94（10.35～14.77）μm×8.00（6.93～9.60）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；斯氏體明顯，孢子囊殘體由細小的顆粒組成，呈團狀，分布于子孢子之間。

山羊艾美耳球蟲（E.caprina）（圖1-8）：卵囊呈橢圓形或略呈卵圓形，據(jù)對34個卵囊的測量，大小為33.52（25.82～42.67）μm×24.70（18.37～33.66）μm，平均形狀指數(shù)1.36；囊壁兩層，外層光滑，黃綠色，厚0.92 μm，內(nèi)層棕紅色或棕黃色，厚0.55 μm；無極帽，卵膜孔寬而明顯，邊緣有皺褶；有極粒，無卵囊殘體。孢子囊呈長卵圓形，大小為15.15（11.03～17.16）μm×8.55（7.19～9.80）μm，子孢子頭尾相鄰縱列于孢子囊中；有斯氏體，孢子囊殘體由小顆粒組成，分布于子孢子之間。

圖1 山羊球蟲種類顯微照片（10×40）

4 討論與小結(jié)

1）本次調(diào)查結(jié)果顯示，畢節(jié)市山羊球蟲不僅感染率高，種類多，且多為混合感染，其感染率高達96.75%，感染強度在100～421 700枚卵囊之間；感染種類有8種艾美耳球蟲，其中感染5～7種的有43.33%，感染2～4種的有53.33%。究其原因，與當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)管理方式和自然生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。畢節(jié)市山羊均以放牧為主，羊只在河邊、塘邊、溝壑、草山草坡隨地便溺，給球蟲的感染和傳播造成了良好機會；另外畢節(jié)市地形復(fù)雜，地勢西高東低，呈階梯狀下降，垂直變化明顯，形成了中溫帶、南溫帶、北亞熱帶、中亞熱帶等立體氣候類型，冬無嚴寒、夏無酷署，為球蟲的體外發(fā)育提供了廣泛的生態(tài)選擇，利其生長發(fā)育。

2）這次調(diào)查共鑒別出8種艾美耳屬球蟲。據(jù)文獻資料報道［3-9］，能致病的山羊球蟲主要有克氏艾美耳球蟲（Eimeria christenseni）、阿氏艾美耳球蟲（E.arloingi）、柯雅艾美耳球蟲（E.ninakohlyakimovae）、艾麗艾美耳球蟲（E.alijevi）。本次調(diào)查證明這4種球蟲在8個縣（區(qū)）、24個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、26個養(yǎng)殖場/戶的羊只中均有存在，其感染率分別為16.67%、80.00%、56.67%和63.33%，建議在每年的春夏秋期間，選用地克珠利或鹽酸氨丙啉（兩種藥物交替使用，以免產(chǎn)生耐藥性）、各進行一次預(yù)防性驅(qū)蟲，同時加強圈舍、糞便和環(huán)境衛(wèi)生的管理。筆者用這兩種藥物做過山羊球蟲病防治藥物分組比對試驗，地克珠利用藥后，球蟲卵囊的減少率為99.74%。鹽酸氨丙啉用藥后，球蟲卵囊的減少率為88.77%。兩種藥物均由江蘇南京農(nóng)大動物藥業(yè)有限公司張寶康老師介紹提供，并在其指導(dǎo)下使用。使用方法為兩種藥物均按1 kg體重0.25 g，均勻攪拌于精飼中飼喂，1日1次，連用4日。

3）據(jù)對定性檢查的339份和定量檢查的328份山羊糞便樣品的檢查結(jié)果分析：就羊群間的感染情況看，其總感染率96.75%（328/339），平均感染強度8 570枚；就羊只年齡間的感染情況來看，半歲以下羊只的感染率為99.18%（121/122），平均感染強度為9 173枚，半歲以上感染率95.39%（207/217），平均感染強度8 216枚；就危害程度來看，嚴重感染［2］的羊2只（OPG值在130 000～472 700枚之間)，中度感染羊有69只（OPG值在10 000～55 300枚之間)，輕度感染的羊有257只（OPG值在100～9 900枚之間的)；就自然環(huán)境海拔高度看，海拔高度在1 202～1 763 m的感染率97.50%（195/200），平均感染強度7 058枚，海拔高度在1 963～2 445 m的感染率95.68%（133/139），平均感染強度10 785枚。這一系列的結(jié)果顯示，畢節(jié)市的山羊球蟲感染普遍，且半歲以下羊的感染率和平均感染強度均高于半歲以上的羊。雖然大多數(shù)的羊只僅屬于輕度感染，但防治工作不容忽視，應(yīng)引起各級有關(guān)部門和防治機構(gòu)的足夠重視，制定防治方案時也應(yīng)充分考慮到上述各個方面的因素。

4）本文所采用的應(yīng)用電腦技術(shù)鑒別球蟲卵囊的方法，與筆者已發(fā)表［1］文章中的方法相比，僅在測量卵囊大小的工具上有所改進。本文所用測量工具為顯微鏡二維測量軟件，按照軟件說明書定標(biāo)（確定圖像尺寸與真實尺寸的比例）后，只需將鼠標(biāo)拉黑所要測量的部位，電腦即可自動顯示所測部位實際大小的數(shù)據(jù)（見圖1-9）；《探索》一文中所用測量工具為屏幕直尺，而屏幕直尺僅相當(dāng)于目鏡測微尺，在電腦顯示屏上測量卵囊時，所得的數(shù)據(jù)還要通過再次人工換算才能得到所測部位的實際大小。兩者相比，在測量卵囊時，測量軟件比屏幕直尺更為精確和方便，但測量軟件需投入資金，而屏幕直尺在網(wǎng)上可免費下載?？傊畠煞N方法都比在光學(xué)顯微鏡下測量卵囊更加方便和準確，并且直接在電腦顯示屏上擷取到的球蟲卵囊彩色照片與在顯微鏡下觀察到的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和顏色基本一樣，與以往采用人工描繪的卵囊形態(tài)結(jié)構(gòu)模式圖相比更為直觀，對卵囊的鑒別有一定的參考價值。

5）本次調(diào)查范圍廣，面積大，調(diào)查結(jié)果基本上反映了畢節(jié)市山羊球蟲種的感染狀況，為制定羊球蟲病的防治方案提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

［1］阮正祥，陳興忠，何雪鋒，等.山羊球蟲種類調(diào)查與電腦技術(shù)應(yīng)用于卵囊測量方法的探索［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2011，19（6）：44-48.

［2］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T18647-2002動物球蟲病診斷技術(shù)［S］.北京：中國標(biāo)準出版社，2002.

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［4］孫志輝，章孝斌,劉峻，等.羊場山羊球蟲感染情況調(diào)查研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（18）：297-298.

［5］楊智青，丁海榮，陳應(yīng)江，等.江蘇沿海地區(qū)山羊球蟲病發(fā)生機制及防治策略［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（21）：125-126.

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［9］彼得L朗.球蟲生物學(xué)［M］.蔣金書，譯.南寧：廣西科技出版社，1990：14-15.

Application of Computer Technology in Identification of Goat Coccidiosis Species

Ruan Zheng-xiang，LongDong-mei，Liu Jun，et al
（Bijie Center for Animal Disease Control，Bijie 551700，Guizhou，China）

A total of 339 goat fecal specimens were collected in Bijie city of Guizhou Province and examined for the presence of coccidian oocysts by using floating method,McMaster's method and oocyst cultures.A color digital camera with binocular optical microscope was linked to a computer so that observation,recording and measurement of coccidian oocysts could be completed on the computer screen.The positive rate of coccidian oocysts was 96.72%and OPG ranged from 100 to 472 700（average 8 570）. Eimeria tenella was identified in 8 fecal specimens and the morphology of their oocysts was described.These results demonstrated that the direct observation,recordingand measuringoocysts on the computer were more convenient than under the microscope not only,but alsomore accurate.

Eimeria;species;survey;computer technology

S827.7

A

2095-3887（2014）02-0039-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.013

2014-02-17

阮正祥（1955-），男，高級獸醫(yī)師，獸醫(yī)專業(yè)。