邵鵬帥，解宏圖，鮑雪蓮，梁 超?

（1.濱州學(xué)院山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點實驗室，山東濱州 256603；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016）

微生物對土壤有機質(zhì)（SOM）形成具有重要的作用，微生物通過自身合成代謝產(chǎn)物（特別是微生物細胞及其死亡殘體），即微生物通過利用凋落物以及SOM合成微生物生物量，以微生物殘體的形式貢獻土壤有機碳（SOC）的形成和積累[1-2]。以往的研究指出微生物殘體最大能貢獻80%左右的SOM[3]，表明微生物在 SOC形成以及周轉(zhuǎn)過程中具有重要的作用。微生物殘體緩慢的周轉(zhuǎn)速率可以表征生態(tài)系統(tǒng)演替過程中 SOC的動態(tài)變化，反映土壤碳的“遺留效應(yīng)”[4]。研究發(fā)現(xiàn)微生物殘留物主要由化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的氨基糖組成，氨基葡萄糖主要來自于真菌，而胞壁酸專一來源于細菌，兩者能夠大致區(qū)分真菌、細菌殘體對 SOC的相對貢獻[5-6]。最近的一項研究綜合評估了全球森林、草地和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氨基糖在土壤中的含量，指出氨基糖在SOC中的比例大致為6.19%～8.33%[7]。因此，微生物標(biāo)識物—氨基糖是合適的指標(biāo)來評估長期森林次生演替過程中土壤微生物殘體的動態(tài)變化，并被應(yīng)用于評價微生物殘體對SOC的貢獻。

森林次生演替是森林生態(tài)系統(tǒng)地上和地下生物群落結(jié)構(gòu)隨時間變化的過程，演替時間序列可以是幾十年甚至幾百年[8]。森林次生演替過程中生物以及非生物因素發(fā)生變化，包括植物群落結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)力以及SOC的變化[9-10]。改變的植物群落結(jié)構(gòu)以及不同數(shù)量、質(zhì)量的植物殘體輸入影響了土壤有機質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量（即土壤有機質(zhì)組分，通過中紅外光譜特征峰表征）[10]，進而導(dǎo)致土壤微生物群落活性、結(jié)構(gòu)和功能的變化[11]。研究[12]表明，亞熱帶森林次生演替通過影響真菌和細菌群落變化以及土壤碳基質(zhì)的可利用性提高了微生物殘體在SOC中的積累。因此，探究森林次生演替過程中微生物殘體對SOC存儲的調(diào)控作用，有助于理解微生物對土壤碳循環(huán)的調(diào)控以及預(yù)測森林次生演替對全球氣候變化的反饋。此外，凋落物分解以及根系分泌物的垂直梯度變化會導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)、土壤營養(yǎng)以及微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化[13]，可能會改變森林演替過程中微生物殘體及其在SOC庫中的積累。因此，需要進一步探究土壤深度及其與森林演替間的交互作用如何影響微生物殘體。

溫帶森林是重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)，貢獻大約18%的陸地生態(tài)系統(tǒng)碳存儲[14]。Liang等[2]的研究表明微生物殘體對土壤有機碳的貢獻比例大于50%，因此，結(jié)合微生物殘體的研究，能夠更好地闡釋微生物在SOC存儲中的作用，有利于森林SOC的管理和評估。基于森林林齡（即空間替代時間），本研究在中國長白山森林自然保護區(qū)選取了5個森林演替序列（20 a、80 a、120 a、200 a 和≥300 a），采用微生物生物標(biāo)識物以及中紅外光譜等技術(shù)和方法，探究長期森林次生演替過程中土壤不同深度微生物殘體的變化以及微生物殘體對SOC的貢獻。本研究的主要目標(biāo)是明確：（1）森林次生演替對微生物殘體以及其對SOC貢獻的影響；（2）土壤深度如何影響微生物殘體以及微生物殘體對 SOC貢獻；（3）真菌和細菌殘體在微生物殘體對SOC貢獻中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

研究地點位于中國東北吉林省長白山國家森林自然保護區(qū)（42°20′～42°24′N，127°55′～128°06′E），海拔為780～920 m。該地年均降水量大約700 mm，年均溫為2.9 °C，該區(qū)域主要的土壤類型為淋溶土（Alfisol）?；诹铸g選取了5個森林次生演替序列：20 a、80 a、120 a、200 a以及大于等于300 a。森林次生演替過程中植物物種從20 a至300 a發(fā)生了較大改變，從先鋒樹種（如白樺、山楊）為主的闊葉林演替至頂級樹種（如紅松）為主的針闊混交林。森林演替20 a的主要樹種為白樺、山楊；演替80 a的主要樹種為白樺、山楊、蒙古櫟、紫椴、色木槭以及水曲柳，還伴隨著少量的紅松；演替120 a的主要樹種為蒙古櫟、紫椴、色木槭、水曲柳以及紅松，白樺以及山楊大量死亡、甚至消失；演替200 a以及300 a的主要樹種為紅松，伴隨著蒙古櫟、紫椴、色木槭、水曲柳。

1.2 土壤樣品采集與處理

2014年8 月在各個森林次生演替序列的區(qū)域，均勻選取了6個20 m × 15 m的樣方，采集有機質(zhì)層（0～5 cm，主要為半分解和全腐解的凋落物、根以及土壤的混合物）和礦質(zhì)層土壤（5～15 cm，主要是土壤層）。每個樣方隨機采集10個土壤樣品，并且均勻地混成一個樣品。去除有機質(zhì)層土壤樣品中的石頭、動物、大于1 mm的粗根以及根狀莖；礦質(zhì)層土壤樣品過2 mm篩，并去除土壤樣品中的石頭、動物、根以及凋落物。保存于4 ℃的新鮮土壤樣品用于測定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及微生物生物量碳。風(fēng)干土壤樣品用于測定土壤pH、土壤總碳氮含量、中紅外光譜以及氨基糖。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)以及氨基糖分析

稱取過2 mm篩的土壤樣品按一定的比例混入去離子水中（土︰水，m/v= 1︰10（有機質(zhì)層）或 1︰2.5（礦質(zhì)層土壤））。混合液用磁力攪拌器攪動2 min，然后靜置30 min，用pH計測定土壤pH。

球磨儀（MM400，Retsch，德國）研磨過0.15 mm篩的土壤樣品在元素分析儀（Elementar，Langenselbold，德國）上測定總的碳、氮含量。由于長白山偏酸的土壤特性，將總的土壤碳含量定義為SOC。

稱量10 g過2 mm篩的土壤樣品于100 mL的塑料瓶內(nèi)，然后加入 50 mL、2 mol·L–1的 KCl溶液。混合的土壤溶液振蕩、過濾，過濾后的土壤提取液在連續(xù)流動分析儀（Technicon Corporation，Oregon，美國）上測定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的和為土壤無機氮（Soil inorganic nitrogen，SIN）。

研磨過0.15 mm篩的土壤樣品與97%的溴化鉀以一定比例（1︰80w/w）在瑪瑙研缽中研磨混勻，用壓片設(shè)備進行壓片，然后在漫反射傅里葉變換中紅外光譜儀（Thermo Electron Scientific InstrumentsCorp.，Madison，WI，美國）上測定分析 SOM 組分。不同特征峰用來評估SOM不同的碳組分：芳香族碳組分（1 620 cm–1）和多糖（1 034 cm–1）[15]。

氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定土壤微生物生物量碳（microbial biomass carbon，MBC）：MBC = [C（熏蒸）? C（未熏蒸）] / 0.45[16]。微生物熵（部分土壤有機碳被微生物利用、固定并轉(zhuǎn)化為微生物生物量）的計算方法：微生物熵= MBC/SOC[17]。

參照Zhang和Amelung[18]的方法提取土壤氨基糖。氨基糖提取液在氣相色譜儀（Agilent 7890B GC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）上進行測定分析。Agilent 7890B GC配置HP-5色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）以及火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）。1 μL 氨基糖提取液進樣至色譜柱進行測定，N2作為載氣，流速為0.6 mL·min–1。氣相色譜進樣口溫度設(shè)定為 250 °C，分流比為 30︰1。參照標(biāo)準(zhǔn)樣品中三種氨基糖的出峰時間來分離土壤氨基糖。

根據(jù)下面的公式計算微生物殘體[19]：微生物殘體含量/（g·kg–1）=真菌殘體[（氨基葡萄糖（mmol）–2×胞壁酸（mmol））×179.2×9]+細菌殘體[胞壁酸（g·kg–1）×45]。其中 179.2 是氨基葡萄糖的分子質(zhì)量，9是真菌氨基葡萄糖轉(zhuǎn)換為真菌殘體碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)，45是細菌胞壁酸轉(zhuǎn)換為細菌殘體碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)。微生物（真菌、細菌）殘體對SOC的貢獻=微生物（真菌、細菌）殘體含量/SOC。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

雙因素方差分析檢測森林次生演替、土壤深度及其交互作用對微生物生物量參數(shù)、微生物殘體以及殘體對SOC貢獻的顯著性。單因素方差分析和析因分析（Tukey’s post-hoc）用于檢測不同土壤深度森林次生演替過程中微生物生物量參數(shù)、微生物殘體以及殘體對SOC貢獻的顯著性。所有的統(tǒng)計分析在SAS V.8.1軟件上執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 不同森林次生演替序列和土壤深度微生物生物量的變化

森林次生演替導(dǎo)致MBC顯著變化（P< 0.01），而未影響MBC/SOC（P> 0.05）；MBC和MBC/SOC在不同土壤深度（有機質(zhì)層和礦質(zhì)層）具有顯著差異（P< 0.001），而其與森林演替之間無交互作用（表1）。在不同土壤深度，森林次生演替過程中 MBC和MBC/SOC的變化趨勢存在差異（圖1）。在有機質(zhì)層，森林次生演替20～120 a MBC逐漸增加，隨后呈現(xiàn)下降趨勢（圖1a）；森林次生演替 80 a的MBC/SOC高于其他4個演替序列（圖1b）。在礦質(zhì)層，森林次生演替 20～120 a MBC逐漸增加，隨后保持相對不變（圖1a）；森林次生演替20～200 a的MBC/SOC逐漸增加，在300 a呈現(xiàn)下降趨勢（圖1b）。土壤有機質(zhì)層MBC顯著高于礦質(zhì)層MBC（P< 0.001），而有機質(zhì)層 MBC/SOC顯著低于礦質(zhì)層MBC/SOC（P< 0.001）（圖1）。

表1 森林次生演替和土壤深度作用下微生物生物量碳（MBC）、微生物殘體及其對土壤有機碳（SOC）貢獻Table 1 Microbial biomass carbon (MBC)，the content of microbial residues and their contributions to soil organic carbon (SOC) relative to stage of secondary forest succession and soil depth

2.2 不同森林次生演替序列和土壤深度微生物殘體含量的變化

森林次生演替和土壤深度顯著影響了微生物、真菌以及細菌殘體的含量（P< 0.001，表1）；此外，森林演替與土壤深度對微生物和真菌殘體的影響存在顯著的交互作用（P< 0.001），然而對細菌殘體的影響不存在交互作用（表1）。在有機質(zhì)層，從森林次生演替序列20 a到200 a微生物以及真菌殘體含量顯著增加（P< 0.01），而在演替300 a顯著降低；在礦質(zhì)層，演替20 a的微生物以及真菌殘體含量低于其他4個演替序列（P< 0.01，圖2a，圖2b）。在兩個土壤深度，演替80～300 a的細菌殘體含量高于演替20 a的細菌殘體含量（P< 0.01，圖2c）。此外，微生物、真菌和細菌殘體的含量在土壤有機質(zhì)層顯著高于礦質(zhì)層（P< 0.001）。有機質(zhì)層和礦質(zhì)層真菌、細菌殘體占總的微生物殘體的比例發(fā)生變化。從有機質(zhì)層到礦質(zhì)層，真菌殘體占總的微生物殘體的比例在下降（83.47%下降至 79.23%），細菌殘體占總的微生物殘體的比例在增加（16.53%上升至 20.77%）（圖2）。

2.3 不同森林次生演替序列和土壤深度微生物殘體對SOC的貢獻

森林次生演替顯著改變了微生物以及真菌殘體對SOC的貢獻（P<0.05），而未影響細菌殘體對SOC的貢獻；土壤深度顯著影響了微生物、真菌以及細菌殘體對SOC的貢獻（P< 0.001），而其與森林演替之間無交互作用（表1；圖3）。在有機質(zhì)層和礦質(zhì)層，森林演替 80～200 a微生物以及真菌殘體對SOC的貢獻顯著高于森林演替20 a（P< 0.05），而在300 a呈現(xiàn)下降趨勢（圖3a，圖3b）。此外，有機質(zhì)層土壤微生物、真菌和細菌殘體對SOC的貢獻（微生物33.74%；真菌28.12%；細菌5.62%）顯著低于礦質(zhì)層土壤微生物、真菌和細菌殘體對SOC的貢獻（微生物54.36%；真菌42.76%；細菌11.60%）（P< 0.001，圖3）。

2.4 土壤化學(xué)特性與微生物殘體參數(shù)間的關(guān)系

本研究應(yīng)用路徑分析揭示土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物殘體間的因果關(guān)系，并探究不同土壤因子對解釋不同森林次生演替序列和土壤深度微生物殘體變化的相對貢獻（圖4）。在兩個土壤深度，SOC、土壤無機氮（SIN）以及土壤有機質(zhì)芳香族組分/多糖（Aro/Poly）通過影響MBC和MBC/SOC間接地導(dǎo)致森林次生演替過程中微生物殘體含量（即真菌和細菌殘體）的變化；MBC和MBC/SOC均與真菌和細菌殘體含量顯著正相關(guān)（P< 0.05）。微生物殘體對 SOC的貢獻與真菌和細菌殘體含量之間的相關(guān)性在兩個土壤深度存在不一致：在有機質(zhì)層，微生物殘體對 SOC的貢獻與真菌殘體含量間顯著正相關(guān)（P<0.01），而與細菌殘體含量之間關(guān)系不顯著（P>0.05）；在礦質(zhì)層，微生物殘體對 SOC的貢獻與真菌殘體含量間顯著正相關(guān)（P< 0.01），而與細菌殘體含量間顯著負(fù)相關(guān)（P< 0.01）。此外，微生物殘體對 SOC的貢獻與 MBC/SOC之間顯著正相關(guān)（P<0.001）。

3 討 論

3.1 森林次生演替過程中土壤微生物殘體的積累

微生物殘體是相對穩(wěn)定的 SOM組分，對 SOM的形成具有重要的貢獻[20-21]。此外，微生物殘體作為穩(wěn)定的SOM組分，可反映長期的生態(tài)系統(tǒng)變化[4，22]。森林次生演替促進了有機質(zhì)層和礦質(zhì)層土壤微生物殘體的積累，特別是在森林次生演替序列80～200 a。森林次生演替增加了真菌殘體對SOC的貢獻，而未改變細菌殘體對SOC的貢獻（圖3b，圖3c），這些研究表明真菌殘體的積累對 SOC的增加具有較大的貢獻。此外，森林演替過程中微生物殘體對SOC的貢獻與真菌殘體顯著正相關(guān)，而與細菌殘體負(fù)相關(guān)（圖4），也表明真菌殘體在 SOC積累中的重要性。真菌和細菌殘體不同的化學(xué)穩(wěn)定性可能是導(dǎo)致兩者對SOC貢獻差異的原因，一些研究指出真菌殘體的化學(xué)穩(wěn)定性高于細菌殘體[23-24]。真菌殘體不易被分解利用，通過與土壤團聚體以及礦物結(jié)合能在土壤中保存幾十年甚至幾百年[2，25]，因此真菌殘體的積累有利于SOC的存儲。然而，細菌殘體相對易被微生物分解利用，其較快的周轉(zhuǎn)代謝不利于微生物殘體對SOC的直接貢獻。

生態(tài)系統(tǒng)主要通過兩個途徑導(dǎo)致SOC存儲：植物碳輸入（包括凋落物以及根系分泌物）和微生物代謝產(chǎn)物（如微生物殘體）。諸多的研究已經(jīng)探究了植物在 SOC存儲的作用[26-27]，而微生物在植物轉(zhuǎn)化為 SOC的過程中具有重要的作用。微生物通過釋放胞外酶分解植物殘體，同時微生物也利用植物來源的碳同化合成微生物生物量；微生物死亡后，部分微生物細胞以殘體的形式轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的SOC[28-29]。森林次生演替序列80～200 a微生物殘體對SOC的貢獻增加（圖3a），表明在這個演替序列更多的植物來源碳通過微生物的同化代謝合成微生物生物量，微生物快速的代謝周轉(zhuǎn)導(dǎo)致更多微生物殘體形成SOC。森林次生演替過程中可利用性氮（即無機氮）增加可能間接地影響微生物殘體含量，主要是高的土壤可利用氮會促進植物生長，增加的凋落物以及植物光合碳輸入（根系分泌碳）刺激微生物生長代謝，導(dǎo)致更多微生物生物量合成，進而促進微生物殘體積累。本研究結(jié)果顯示，森林次生演替過程中微生物殘體與MBC之間顯著正相關(guān)（圖4），表明微生物生物量通過細胞代謝轉(zhuǎn)化為比較穩(wěn)定的微生物殘體，導(dǎo)致微生物殘體在土壤中積累[30-31]。此外，微生物通過利用外源碳同化合成微生物生物量，凋落物化學(xué)性質(zhì)以及土壤有機質(zhì)組分差異會影響微生物殘體的積累[32]。Shao等[10]的研究指出森林演替80～120 a植物群落主要以闊葉林為主，具有低的凋落物碳氮比，表明此演替序列的植物來源碳易于被微生物利用；而且，此演替序列高的易利用SOM組分（即低的芳香族碳組分/多糖組分）有利于微生物合成自身生物量，導(dǎo)致更多微生物殘體對SOC的貢獻。微生物殘體對SOC的貢獻與微生物熵（MBC/SOC）間的顯著正相關(guān)性（圖4）也解釋了森林次生演替80～120 a高的微生物碳利用有利于更多微生物代謝產(chǎn)物的積累，進而增加了微生物殘體對SOC的貢獻。

然而，森林次生演替300 a土壤微生物殘體含量及其對 SOC的貢獻顯著下降（圖2，圖3），主要歸因于低的微生物碳利用。森林演替300 a顯著增加的凋落物碳氮比以及SOM芳香族碳組分與多糖組分的比值表明凋落物以及SOM的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，更難被微生物分解利用，抑制了微生物活性以及微生物生物量合成。此外，難分解凋落物以及SOM組分導(dǎo)致微生物消耗更多的有機碳基質(zhì)來產(chǎn)生胞外酶，用于有機質(zhì)降解，而用于合成微生物生物量的碳基質(zhì)降低，進而抑制了微生物殘體的積累[33]。

3.2 不同土壤深度微生物殘體的變化

森林次生演替過程中有機質(zhì)層土壤微生物殘體的含量高于礦質(zhì)層微生物殘體的含量（圖2），主要歸因于有機質(zhì)層更高的營養(yǎng)（例如碳、氮）；SOC以及土壤無機氮通過影響微生物生物量間接地影響了微生物殘體的積累[34]。此外，從有機質(zhì)層到礦質(zhì)層，相對于細菌殘體，真菌殘體占微生物殘體的比例降低（圖2b，圖2c）。不同土壤深度真菌以及細菌殘體占微生物殘體比例的差異可能由于真菌以及細菌對 SOM 的利用策略不同所導(dǎo)致[35]。在有機質(zhì)層更高的土壤碳氮比以及難分解SOM組分（即芳香族碳組分/多糖組分），表明更多難利用的SOM組分有利于真菌的生長，真菌主導(dǎo)微生物群落；在礦質(zhì)層，降低的土壤碳氮比以及增加的脂肪族、多糖組分導(dǎo)致微生物群落由真菌主導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毦鲗?dǎo)。因此，從有機質(zhì)層到礦質(zhì)層土壤微生物群落由真菌主導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毦鲗?dǎo)，進而導(dǎo)致真菌殘體占微生物殘體的比例下降，而細菌殘體占微生物殘體的比例增加。

盡管有機質(zhì)層土壤微生物殘體的含量高于礦質(zhì)層微生物殘體的含量，但有機質(zhì)層微生物殘體對SOC的貢獻低于礦質(zhì)層微生物殘體的貢獻（圖3）。不同土壤深度微生物熵（表征微生物對SOC基質(zhì)的利用）的變化能解釋有機質(zhì)層和礦質(zhì)層微生物殘體對SOC貢獻的不同。森林次生演替過程中，有機質(zhì)層微生物對土壤碳基質(zhì)的利用低于礦質(zhì)層微生物對碳基質(zhì)的利用，表明有機質(zhì)層微生物僅僅能利用較少的SOM合成自身生物量，有機質(zhì)層高的SOC主要來源于植物碳，微生物源碳貢獻了較小的SOC；而在土壤礦質(zhì)層，微生物能利用同化更多的SOM，導(dǎo)致更多微生物生物量合成，進而增加了微生物殘體在SOC中的貢獻。

4 結(jié) 論

微生物殘體反映了微生物對環(huán)境變化的長期效應(yīng)，對土壤有機碳（SOC）的存儲具有重要作用。森林次生演替80～200 a促進了微生物殘體的積累，而300 a微生物殘體下降，歸因于微生物對SOC以及其他營養(yǎng)（如氮）的可利用性。森林次生演替過程中真菌殘體與微生物殘體對 SOC貢獻呈正相關(guān)關(guān)系，而細菌殘體與微生物殘體對SOC貢獻呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明真菌殘體的積累有利于SOC的存儲。此外，從有機質(zhì)層到礦質(zhì)層微生物對SOC基質(zhì)的利用差異導(dǎo)致真菌殘體對SOC貢獻的比例下降，而細菌殘體對SOC貢獻的比例增加。通過探究長期森林生態(tài)系統(tǒng)演替過程中微生物殘體及其對 SOC庫的貢獻，為從微生物代謝產(chǎn)物角度闡釋生態(tài)系統(tǒng)碳動態(tài)提供理論參考。

致 謝感謝中國科學(xué)院長白山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站何錫昌老師為試驗樣地選取提供的幫助。