袁婷婷，趙 騫，董 艷

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

蠶豆是重要的食用豆類作物之一，富含蛋白質(zhì)，作為糧食、蔬菜和飼料在世界各地廣泛種植[1]。我國是世界上蠶豆栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的國家[1]。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2011年中國蠶豆生產(chǎn)面積為0.92萬hm2，總產(chǎn)量155萬t，分別占世界生產(chǎn)總面積和總產(chǎn)量的39.1%和38.4%[1]。云南是我國蠶豆生產(chǎn)面積和產(chǎn)量最大的省份，其產(chǎn)量約占中國總產(chǎn)的27%[2]。

中國耕地面積逐年減少，耕種條件限制嚴(yán)重，不得不實(shí)施連作制度，導(dǎo)致了土傳病害嚴(yán)重和土壤肥力逐年下降等問題[3]。蠶豆是典型的忌連作作物，近年來隨著蠶豆生產(chǎn)的不斷發(fā)展，土地資源短缺、種植習(xí)慣和經(jīng)濟(jì)利益等原因，蠶豆連作現(xiàn)象較為普遍，由此引發(fā)的蠶豆連作障礙問題日益凸顯[4]。由蠶豆專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium.oxysporumf.sp.fabae，F(xiàn)OF）引起的枯萎病是蠶豆連作障礙的重要表現(xiàn)，該病嚴(yán)重制約了蠶豆產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。尖孢鐮刀菌屬于兼性寄生菌，在無蠶豆存在時(shí)，其休眠孢子能在土壤中存活10 a以上仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性，因此土傳蠶豆枯萎病的防控十分困難[5]。連作蠶豆枯萎病的發(fā)生與自毒作用密切相關(guān)，蠶豆根系分泌物和殘茬腐解物中酚酸類物質(zhì)的釋放與積累是引起土壤微生物區(qū)系失衡、刺激病原菌生長并導(dǎo)致蠶豆生長不良、枯萎病加重的直接原因[6]。前期在田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在同一塊土地上連續(xù)多年種植蠶豆，出現(xiàn)出苗率低，生長勢弱，枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的現(xiàn)象；進(jìn)一步通過高效液相色譜在連作土壤中檢測到7種酚酸，其中阿魏酸是含量較高且自毒作用較強(qiáng)的化感物質(zhì)，在蠶豆根與病原菌的互作中扮演著重要的角色，被認(rèn)為是導(dǎo)致蠶豆連作障礙的主導(dǎo)因素[7]。

明確病原菌的致病因子和作用機(jī)制，是解決植物病害控制的關(guān)鍵。組織結(jié)構(gòu)是寄主抵御病原菌侵染的第一道物理屏障，病原真菌在侵入寄主過程中，首先產(chǎn)生各種細(xì)胞壁降解酶（cell wall degrading enzymes，CWDEs）水解構(gòu)成植物細(xì)胞壁的高分子聚合物果膠、纖維素等，造成寄主作物細(xì)胞壁成分降解，細(xì)胞壁的降解不但可以幫助病原真菌突破物理屏障入侵寄主作物，還可從作物細(xì)胞內(nèi)釋放出多糖等營養(yǎng)物質(zhì)供真菌生長，因此，細(xì)胞壁降解酶活性與真菌的致病力密切相關(guān)[8]。蘆筍自毒物質(zhì)損傷蘆筍根尖和表皮細(xì)胞，從而增加了鐮刀菌侵染的機(jī)會(huì)[9]。草莓根系分泌的對(duì)羥基苯甲酸脅迫下，草莓根系組織結(jié)構(gòu)受破壞程度加重，根系中尖孢鐮刀菌感染率顯著提高[10]。表明連作自毒物質(zhì)可加劇對(duì)寄主組織結(jié)構(gòu)的破壞，降低其組織結(jié)構(gòu)抗性。寄主作物感知到病原菌的侵染，可迅速啟動(dòng)一系列的抗性反應(yīng)，如木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和膠質(zhì)等累積，封閉受侵染或破裂的導(dǎo)管，防止真菌孢子隨作物的蒸騰作用上行擴(kuò)展，有效抑制病原菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶擴(kuò)散。

間作是利用種間互作控制病蟲害發(fā)生、提高糧食產(chǎn)量的傳統(tǒng)農(nóng)作措施[11]。利用植物化感作用而采用的間作模式，是緩解連作障礙的有效手段[12]。前期研究中發(fā)現(xiàn)，小麥與蠶豆間作顯著增加了根際微生物數(shù)量，提高了根際微生物活性而增加其對(duì)酚酸類碳源的降解，最終有效控制了蠶豆枯萎病的發(fā)生[7]。然而，有關(guān)連作自毒物質(zhì)阿魏酸與FOF雙重脅迫下，間作蠶豆根系中細(xì)胞壁降解酶活性有何變化，間作蠶豆是否主動(dòng)改變其組織結(jié)構(gòu)并影響木質(zhì)素、胼胝質(zhì)沉積以抵御FOF侵染尚不清楚。本研究以小麥/蠶豆間作體系為研究對(duì)象，通過水培試驗(yàn)、FOF接種和阿魏酸外源添加手段，研究間作蠶豆組織結(jié)構(gòu)變化對(duì)自毒物質(zhì)和病原菌脅迫的響應(yīng)，旨在揭示自毒物質(zhì)加重蠶豆枯萎病發(fā)生的組織病理學(xué)機(jī)制及間作緩解效應(yīng)；通過田間試驗(yàn)，驗(yàn)證小麥/蠶豆間作對(duì)蠶豆連作障礙的緩解效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水培試驗(yàn)：于2018年10月—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院溫室大棚進(jìn)行。

供試蠶豆品種為“89-147”，小麥品種為“云麥53”。供試病原菌為蠶豆?；图怄哏牭毒‵OF），其分離和培養(yǎng)參照陳玲等[4]的方法進(jìn)行。

試驗(yàn)為雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，A因素為阿魏酸處理，設(shè)四個(gè)濃度（0、50、100、200 mg·L–1），B 因素為種植模式，設(shè)蠶豆單作和小麥與蠶豆間作，每處理重復(fù)3次，共計(jì)24盆。單作每盆種植6株蠶豆，間作每盆種植3株蠶豆和9株小麥，24 h通氣泵通氣。

將蠶豆、小麥種子于室溫下浸泡24 h，置于25 ℃下發(fā)芽后播種于無菌石英砂中。當(dāng)蠶豆幼苗長至4～6片真葉時(shí)，將其放入盛有含不同濃度（0、50、100、200 mg·L–1）阿魏酸的 2 L Hoagland 營養(yǎng)液容器中，間作處理每盆同時(shí)移栽9株3葉期小麥。待阿魏酸處理 2 d 后，將 25 mL 濃度為 1×106cfu·mL–1的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液加入該營養(yǎng)液中，每3天換新鮮的營養(yǎng)液并添加相應(yīng)的阿魏酸，于40 d后采收測定相應(yīng)指標(biāo)。

大田試驗(yàn)：大田試驗(yàn)于2018年10月—2019年5月在云南省玉溪市峨山縣峨峰村進(jìn)行。

試驗(yàn)為單因素設(shè)計(jì)，為蠶豆單作和蠶豆與小麥間作2種種植模式。每處理重復(fù)3次，共計(jì)6個(gè)小區(qū)。單、間作蠶豆均為點(diǎn)播，行距0.3 m，株距0.15 m。間作小區(qū)按 2行蠶豆、6行小麥種植。單、間作蠶豆播種前以基肥的形式施入N（尿素）90 kg·hm–2、P2O5（普鈣）100 kg·hm–2、K2O（硫酸鉀）100 kg·hm–2，間作小麥氮肥施肥量為蠶豆的2倍，磷、鉀肥用量與蠶豆相同。

1.2 蠶豆枯萎病調(diào)查

水培試驗(yàn)：于蠶豆移栽后40 d進(jìn)行枯萎病調(diào)查，單作蠶豆每處理調(diào)查3盆，每盆調(diào)查6株，共計(jì)18株；間作蠶豆每處理調(diào)查3盆，每盆調(diào)查3株，共計(jì)9株。蠶豆枯萎病分級(jí)方法按5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查[7]。

田間試驗(yàn)：于蠶豆分枝期、開花期和成熟期進(jìn)行3次調(diào)查，調(diào)查蠶豆的選點(diǎn)為在蠶豆單作小區(qū)沿對(duì)角線方向隨機(jī)選取5點(diǎn)，每點(diǎn)2株，共調(diào)查10株；間作小區(qū)在第一個(gè)種植帶內(nèi)選3點(diǎn)，第二個(gè)種植帶內(nèi)選2點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查2株，共計(jì)調(diào)查10株。

發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

發(fā)病率/%=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100

病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)值）/（最高級(jí)值×調(diào)查總株數(shù)）×100

1.3 蠶豆根細(xì)胞壁降解酶活性測定

果膠酶、纖維素酶和淀粉酶活性測定均采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）進(jìn)行[13]。蛋白酶活性測定采用改進(jìn)的 Kunit蛋白酶活性法[14]。每處理重復(fù)3次，取平均值。

1.4 蠶豆根系木質(zhì)素含量測定和胼胝質(zhì)沉積觀察

采用葉素芬[15]的巰基乙酸法進(jìn)行蠶豆根系木質(zhì)素含量測定。胼胝質(zhì)染色采用苯胺藍(lán)法，根據(jù)王寧等[16]的方法制作永久石蠟切片，依次將切片放入二甲苯I 20 min，二甲苯II 20 min，無水乙醇I 5 min，無水乙醇II 5 min，75%酒精5 min后，用自來水進(jìn)行沖洗。將切片放入苯胺藍(lán)染液5～10 min，再用自來水沖洗后，置于 60 ℃烤箱內(nèi)烤干，放入二甲苯透明5 min，使用中性樹膠封片，用正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100，日本）藍(lán)色激發(fā)光下觀察。

1.5 透射電鏡制樣和觀察

在離根尖1～2 cm處取樣，取樣長度約5 mm，使用戊二醛固定，室溫放置2 h，再轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱。0.1 mol·L–1磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）漂洗3次，每次15 min，1%的鋨酸，0.1 mol·L–1磷酸緩沖液（pH 7.4）室溫固定 5 h 后脫水。使用Epon812樹脂包埋，超薄切片機(jī)（Leica UC7，德國）進(jìn)行切片，進(jìn)行鈾鉛雙染色，室溫干燥過夜后，透射電子顯微鏡（HT7700，日本）下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用WPS 2019軟件處理原始數(shù)據(jù)，SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)各處理間差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 阿魏酸脅迫下間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)生的影響

蠶豆單作條件下，與不添加阿魏酸的處理相比，阿魏酸處理顯著增加枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)（P<0.05）。100 和 200 mg·L–1濃度的阿魏酸處理顯著增加發(fā)病率 3.0倍和 5.0倍，顯著增加病情指數(shù)5.0倍和16.0倍，50 mg·L–1濃度處理對(duì)發(fā)病率和病情指數(shù)均無顯著影響（圖1）。阿魏酸各濃度（50、100和200 mg·L–1）脅迫下，與單作相比，間作均有效地控制了蠶豆枯萎病的發(fā)生和危害（圖1）。100 mg·L–1阿魏酸脅迫下間作使蠶豆枯萎病的發(fā)病率顯著降低31.7%，50和200 mg·L–1濃度處理下，間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)病率無顯著影響；50、100和200 mg·L–1濃度脅迫下，間作顯著降低蠶豆枯萎病病情指數(shù)46.9%、42.5%和28.3%。表明阿魏酸處理增加蠶豆枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，而小麥與蠶豆間作能緩解阿魏酸對(duì)蠶豆枯萎病的促進(jìn)效應(yīng)，其中以50和100 mg·L–1濃度脅迫下間作降低病情指數(shù)的效果較好，暗示了高濃度阿魏酸脅迫下，間作控制枯萎病的效果下降。

2.2 阿魏酸脅迫下間作對(duì)蠶豆細(xì)胞壁降解酶活性的影響

單作條件下，隨阿魏酸處理濃度增加，果膠酶、纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶活性均顯著增加（P<0.05）（圖2）。與不添加阿魏酸的處理相比，50、100、200 mg·L–1阿魏酸處理顯著增加果膠酶活性192.9%、707.1%和1 136%，平均增加678.6%；顯著增加蛋白酶活性396.0%、844.1%和1 279%，平均增加839.6%；顯著增加淀粉酶活性3 056%、4 978%和 16 889%，平均增加 8 308%。100、200 mg·L–1濃度處理顯著增加纖維素酶活性 14.2%和 29.1%，平均增加21.7%，50 mg·L–1濃度處理對(duì)纖維素酶活性無顯著性影響。表明尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶活性均隨阿魏酸處理濃度增加而增加，在200 mg·L–1濃度下刺激作用最強(qiáng)；同時(shí)阿魏酸對(duì)果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的刺激作用較強(qiáng)，而對(duì)纖維素酶的刺激效應(yīng)最弱。

與單作相比，不添加阿魏酸條件下，間作對(duì)蠶豆根系果膠酶和纖維素酶活性均無顯著性影響；50、100和 200 mg·L–1濃度脅迫下，間作使果膠酶活性顯著降低59.8%、32.7%和25.2%，平均降低33.9%；使蛋白酶活性顯著降低60.3%、39.0%和18.9%，平均降低了 39.4%；50、200 mg·L–1濃度下，使淀粉酶活性顯著降低56.6%和50.8%，100 mg L–1濃度下間作對(duì)淀粉酶活性無顯著影響，3個(gè)濃度下平均降低42.3%；0、50、100 mg·L–1濃度脅迫下，間作有降低蠶豆根系纖維素酶活性的趨勢，但單間作處理間差異不顯著，200 mg·L–1濃度脅迫下，間作顯著降低纖維素酶活性10.0%（圖2）。

阿魏酸不同濃度脅迫下，間作均有效抑制了各種細(xì)胞壁降解酶（除纖維素酶外）活性，總體上以50和100 mg·L–1濃度脅迫下間作降低細(xì)胞壁水解酶的效果最好，從平均值來看，間作降低細(xì)胞壁降解酶的效果由高到低依次為淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶。

2.3 阿魏酸脅迫下間作對(duì)蠶豆根系組織結(jié)構(gòu)抗性的影響

2.3.1 對(duì)蠶豆根系木質(zhì)素含量及胼胝質(zhì)沉積的影響 單作條件下，隨阿魏酸處理濃度升高，蠶豆根系木質(zhì)素含量顯著增加（P<0.05）。與對(duì)照相比，阿魏酸 50、100、200 mg·L–1處理顯著增加木質(zhì)素含量52.5%、81.1%和123.3%，平均增加85.6%（圖3）。與單作相比，僅接種尖孢鐮刀菌不添加阿魏酸時(shí)，間作使蠶豆根系木質(zhì)素含量顯著增加 45.5%；阿魏酸50 mg·L–1濃度脅迫下，間作對(duì)木質(zhì)素含量無顯著影響；100和 200 mg·L–1濃度脅迫下，間作使蠶豆根系木質(zhì)素含量增加12.5%和8.3%，但單間作處理間差異均未達(dá)到顯著水平。表明無阿魏酸脅迫時(shí)，間作顯著提高了蠶豆根系木質(zhì)素含量，誘導(dǎo)根系木質(zhì)化反應(yīng)，提高了蠶豆根系的免疫機(jī)能。

植物在遭受病原菌侵染的逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生胼胝質(zhì)等物質(zhì)堵塞通道，阻礙病原真菌進(jìn)入寄主細(xì)胞，減緩病原真菌的侵入速度，出現(xiàn)壞死反應(yīng)。圖4為阿魏酸脅迫對(duì)蠶豆根系胼胝質(zhì)沉積的影響，圖中綠色熒光部分為胼胝質(zhì)。胼胝質(zhì)的沉積反映了尖孢鐮刀菌在蠶豆根系的侵染情況，蠶豆單作條件下，隨阿魏酸處理濃度增加，胼胝質(zhì)沉積也隨之增多，且伴隨有嚴(yán)重的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損，尖孢鐮刀菌的侵染能力增強(qiáng)。

與單作相比，不添加阿魏酸情況下，間作對(duì)胼胝質(zhì)沉積的影響較??；阿魏酸50 mg·L–1脅迫下，間作蠶豆根系的胼胝質(zhì)分布較散，減少了其在中柱的聚集；100 mg·L–1脅迫下，間作蠶豆根系的胼胝質(zhì)沉積有所增加；200 mg·L–1脅迫下，間作蠶豆根系中的胼胝質(zhì)明顯少于單作，但伴有細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損。表明中、低濃度下間作有效地緩解胼胝質(zhì)沉積，減少導(dǎo)管的堵塞，使?fàn)I養(yǎng)和水分能夠正常的運(yùn)輸，進(jìn)而有效緩解蠶豆枯萎病的發(fā)生，但高濃度條件下，單間作均使細(xì)胞破損嚴(yán)重，對(duì)枯萎病的緩解效果不明顯。

2.3.2 對(duì)蠶豆根系超微結(jié)構(gòu)的影響 蠶豆單作條件下，接種尖孢鐮刀菌但不添加阿魏酸時(shí)，細(xì)胞壁輕微加厚，壁上出現(xiàn)少量的乳突，液泡小而多，線粒體球形或長橢圓形，核質(zhì)均勻（圖5a）；50 mg·L–1濃度處理下，細(xì)胞壁明顯加厚，壁上出現(xiàn)大量的乳突，線粒體增多，空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核輕微變形扭曲，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多（圖5b）；100 mg·L–1濃度處理下，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)巨大的空泡，線粒體空泡化加重，線粒體脊模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)扭曲，細(xì)胞器被液泡和細(xì)胞核擠在細(xì)胞壁邊緣，部分細(xì)胞器被消解（圖5c）；而200 mg·L–1濃度處理下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)扭曲變形，細(xì)胞器、細(xì)胞膜和核膜完全消解，細(xì)胞內(nèi)僅剩少量的核質(zhì)（圖5d）。

與單作相比，不添加阿魏酸條件下，間作蠶豆根系細(xì)胞中的空泡少于單作蠶豆，細(xì)胞器完整清晰，細(xì)胞間排列有序，總體變化不明顯（圖5e）。50 mg·L–1阿魏酸脅迫下，間作蠶豆根系細(xì)胞中的空泡化明顯緩解，細(xì)胞核變形，但較單作蠶豆根系細(xì)胞核完整，且變形程度較小（圖5f）；100 mg·L–1阿魏酸脅迫下，間作蠶豆根系細(xì)胞內(nèi)空泡增加且變大，但與單作相比，細(xì)胞質(zhì)外泄情況較少，細(xì)胞核較完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器依然存在于細(xì)胞中（圖5g）；200 mg·L–1阿魏酸脅迫下，間作緩解了蠶豆根系細(xì)胞的變形，且間作蠶豆的細(xì)胞壁明顯厚于單作蠶豆，殘余核質(zhì)較單作多（圖5h）。表明間作有效保護(hù)了蠶豆根系細(xì)胞的完整性，緩解了阿魏酸對(duì)蠶豆根系細(xì)胞的損傷。

2.4 田間小麥與蠶豆間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)生的影響

田間試驗(yàn)表明，從蠶豆開花期到成熟期，枯萎病發(fā)病率及病情指數(shù)均呈增加趨勢，且間作均較單作低（圖6）。與單作相比，蠶豆開花期，間作顯著降低枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)87.6%、83.3%；結(jié)莢期，間作顯著降低發(fā)病率和病情指數(shù)15.0%、42.1%；成熟期，間作顯著降低病情指數(shù) 13.6%，但對(duì)發(fā)病率無顯著影響。表明小麥蠶豆間作能顯著降低蠶豆枯萎病的發(fā)生和危害，尤其在蠶豆開花期的抑制效應(yīng)最明顯，有效緩解蠶豆連作障礙。

3 討 論

3.1 阿魏酸促進(jìn)蠶豆枯萎病發(fā)生而間作減輕蠶豆枯萎病

很早人們就發(fā)現(xiàn)，連作作物根系分泌物具有促進(jìn)土傳病害發(fā)生的效果，并且研究者相繼從連作作物根系分泌物中分離出各種酚酸類物質(zhì)，并證實(shí)了這些酚酸類物質(zhì)具有促進(jìn)病害發(fā)生的效果[16]。楊瑞秀等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜連作自毒物質(zhì)肉桂酸、阿魏酸和苯甲酸對(duì)枯萎病的發(fā)生均具有促進(jìn)作用，且自毒物質(zhì)處理濃度與病情指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。本研究中，水培試驗(yàn)結(jié)果表明，與不添加阿魏酸的對(duì)照相比，阿魏酸中（100 mg·L–1）、高（200 mg·L–1）濃度處理顯著增加蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，且處理濃度越高促進(jìn)效應(yīng)越明顯（圖1）。李石力[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，煙草連作自毒物質(zhì)肉桂酸和肉豆蔻酸均能夠促進(jìn)青枯病菌在根部的定殖與侵染，提高煙草青枯病的發(fā)病程度，其中以肉桂酸的刺激效果最明顯。

間作作為我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的精髓，具有增產(chǎn)、提高養(yǎng)分資源利用效率、增加農(nóng)田生物多樣性和穩(wěn)定性及持續(xù)控制病害的優(yōu)勢[11]。有關(guān)間作控制土傳病害、緩解連作障礙的現(xiàn)象已經(jīng)在大量研究中被觀察到，如西瓜與旱作水稻間作抑制西瓜根際病原菌的生長，降低西瓜枯萎病的病情指數(shù)[19]；小麥與西瓜伴生減輕了西瓜枯萎病的發(fā)生[20]。本研究中，不同濃度阿魏酸脅迫下（水培試驗(yàn)），小麥與蠶豆間作降低了蠶豆枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，以低（50 mg·L–1）、中（100 mg·L–1）濃度阿魏酸脅迫下間作減輕枯萎病危害的效果較好，高濃度（200 mg·L–1）阿魏酸脅迫下，間作控制蠶豆枯萎病危害的效果下降（圖1）。表明間作能較好地減輕土傳病害發(fā)生，但間作緩解蠶豆連作障礙的效果受自毒物質(zhì)脅迫濃度的影響。本研究進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)小麥與蠶豆間作能顯著降低蠶豆枯萎病的危害（圖6）。表明小麥作為化感作物，與蠶豆間作能有效緩解蠶豆連作障礙。

3.2 阿魏酸脅迫下間作降低蠶豆根系細(xì)胞壁降解酶活性

尖孢鐮刀菌可分泌多種細(xì)胞壁降解酶，如：果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等[21]。果膠酶主要分解果膠層，使細(xì)胞離散，組織結(jié)構(gòu)散亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁損傷，并將細(xì)胞壁高聚半乳糖醛酸分解為低聚半乳糖醛酸作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行利用[22]。纖維素酶作用于纖維素及纖維素衍生出來的產(chǎn)物，將纖維素降解為葡萄糖供植物體所利用。蛋白酶和淀粉酶主要作用于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和淀粉，使胞內(nèi)物質(zhì)分散解離[23]。

楊志敏等[8]的研究表明，細(xì)胞壁降解酶是干腐病菌（Fusarium sulphureumSchlechlendahl）侵染和擴(kuò)展過程中主要的致病因子，接種干腐病菌后，馬鈴薯組織內(nèi)干腐病菌分泌的細(xì)胞壁水解酶活性增強(qiáng)，加速干腐病菌侵染馬鈴薯?；ㄉ~腐病菌在花生植株內(nèi)能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等細(xì)胞壁降解酶，這些降解酶與葉腐病菌侵染及花生葉腐病發(fā)生密切相關(guān)[24]。本研究中，與不添加阿魏酸的對(duì)照相比，單、間作條件下，阿魏酸不同濃度處理均促進(jìn)尖孢鐮刀菌產(chǎn)生更高活性的細(xì)胞壁降解酶，其中阿魏酸對(duì)果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的刺激作用較強(qiáng)，而對(duì)纖維素酶的刺激效應(yīng)最弱。與單作相比，阿魏酸脅迫下間作使蠶豆根系果膠酶、纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶活性分別降低 33.9%；6.3%、35.9%和42.3%，降低效應(yīng)由高到低依次為淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶（圖2）。表明間作通過降低蠶豆根系果膠酶活性使細(xì)胞與細(xì)胞間緊密相連，降低淀粉酶和蛋白酶活性使胞內(nèi)物質(zhì)凝聚，最終維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而使胞內(nèi)物質(zhì)的解離和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變形得到改善，延緩鐮刀菌侵入蠶豆根系的速度，降低鐮刀菌的致病力，進(jìn)而有效控制枯萎病的發(fā)生。

3.3 間作提高了阿魏酸脅迫下蠶豆根系組織結(jié)構(gòu)的抗性

酚酸類自毒物質(zhì)脅迫下，病原菌侵入植物體內(nèi)會(huì)分泌細(xì)胞壁降解酶損傷植物根系、抑制植物生長，導(dǎo)致植物組織、細(xì)胞受損，創(chuàng)造有利于病原菌入侵和生長的環(huán)境。研究表明，外界脅迫下植株局部會(huì)迅速木質(zhì)化，即在侵染點(diǎn)周圍形成防御壁等結(jié)構(gòu)屏障（木質(zhì)素），細(xì)胞壁木質(zhì)化是植物受到傷害時(shí)誘導(dǎo)所產(chǎn)生的早期防御反應(yīng)，能夠抑制病原菌酶和毒素對(duì)寄主的破壞，具有機(jī)械抗病性作用[25]。黃瓜連作條件下，黃瓜枯萎病發(fā)病級(jí)別和植株感病程度的增加與胼胝質(zhì)在植株體內(nèi)的積累量呈正相關(guān)關(guān)系[26]。胼胝質(zhì)的積累一方面限制了病原菌的進(jìn)一步侵入，同時(shí)也堵塞導(dǎo)管，抑制了植株體內(nèi)水分與營養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)，加重黃瓜枯萎病危害[26]。

本研究中，阿魏酸處理促進(jìn)單、間作蠶豆根系中木質(zhì)素含量和胼胝質(zhì)沉積增加，但間作蠶豆根系木質(zhì)素含量高于單作，且胼胝質(zhì)沉積少于單作蠶豆（圖3、圖4）。原因可能是低濃度阿魏酸處理使蠶豆根部的防衛(wèi)機(jī)能啟動(dòng)，但隨處理濃度的增加，蠶豆受到的不良脅迫加重，進(jìn)而加劇枯萎病的發(fā)生。與單作相比，相同濃度阿魏酸脅迫下，小麥蠶豆間作能促進(jìn)蠶豆根系木質(zhì)素的分泌，加快受感染部位的木質(zhì)化，減少蠶豆根部導(dǎo)管中胼胝質(zhì)的沉積，阻止尖孢鐮刀菌的進(jìn)一步侵入，減輕導(dǎo)管堵塞，有助于蠶豆抵御自毒物質(zhì)脅迫并保證養(yǎng)分和水分的正常運(yùn)輸，進(jìn)而減緩蠶豆枯萎病的危害；表明間作蠶豆對(duì)病原菌侵染的信號(hào)傳遞更加敏感，能夠有效減少阿魏酸對(duì)植株抗性系統(tǒng)的干擾，減輕植株的導(dǎo)管堵塞情況，提高蠶豆的組織結(jié)構(gòu)抗性。但在高濃度脅迫條件下，胼胝質(zhì)沉積雖有所減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷并未緩解，表明在低、中濃度阿魏酸脅迫下，間作能夠有效的緩解胼胝質(zhì)沉積，提高根系木質(zhì)化程度，但超過該濃度后，由于阿魏酸使細(xì)胞壁水解酶活性增加，破壞了蠶豆自身的防御反應(yīng)，緩解效應(yīng)不明顯。因此，一定濃度阿魏酸脅迫下小麥蠶豆間作可通過提高蠶豆的組織抗性而加強(qiáng)自身防御功能，進(jìn)而有效緩解蠶豆枯萎病的發(fā)生。

化感自毒物質(zhì)通過破壞植物細(xì)胞，干擾植物自身的生理生化過程，降低植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)，加重連作障礙的發(fā)生[27]。楊敏[27]通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，三七根系分泌的皂苷類自毒物質(zhì)Rg1處理使三七根系出現(xiàn)細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞嚴(yán)重變形皺縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮，表現(xiàn)出明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，根系中細(xì)胞壁主要組成成分（纖維素和果膠等）降解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，最終促進(jìn)根腐病菌的侵染。李勇等[28]通過對(duì)人參幼苗根系超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，在連作自毒物質(zhì)苯甲酸脅迫下，人參根系細(xì)胞壁異常增厚，核膜、核仁解體、消散，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿魏酸處理下，蠶豆根系細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁加厚，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多（圖5）。原因可能是阿魏酸脅迫促進(jìn)枯萎病菌侵入蠶豆根系，早期出現(xiàn)細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，加速根系木質(zhì)化程度，抵御自毒物質(zhì)的脅迫反應(yīng)；隨著阿魏酸脅迫濃度增加，細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，暗示了病原菌的進(jìn)一步侵入使細(xì)胞呼吸作用加快，促進(jìn)細(xì)胞膜和細(xì)胞器消解、細(xì)胞核解體等不良反應(yīng)[29]。表明阿魏酸脅迫降低蠶豆根系的組織結(jié)構(gòu)抗性，促進(jìn)尖孢鐮刀菌侵入蠶豆，導(dǎo)致枯萎病發(fā)生。

小麥與蠶豆間作降低了蠶豆根系細(xì)胞壁水解酶活性，減緩細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞器等的消解（圖5），阻止尖孢鐮刀菌的進(jìn)一步侵入，使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受損狀況得到明顯的緩解，細(xì)胞的完整性明顯提高，但隨著阿魏酸處理濃度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度均較嚴(yán)重，表明間作緩解效應(yīng)具有一定的濃度限制，超過一定濃度脅迫時(shí)，間作緩解效應(yīng)不明顯。因此，在低、中濃度累積條件下，間作能有效緩解阿魏酸對(duì)蠶豆根系組織結(jié)構(gòu)的破壞作用，提高蠶豆的組織結(jié)構(gòu)抗性，降低尖孢鐮刀菌的致病力而提高蠶豆的健康程度。

阿魏酸作為蠶豆根系分泌的主要次生代謝產(chǎn)物，隨著其在土壤中的不斷積累，可與土壤中累積的病原菌協(xié)同作用，促進(jìn)土傳病害的發(fā)生，加劇蠶豆連作障礙。本研究在水培試驗(yàn)中設(shè)置了50、100、200 mg·L–13個(gè)濃度梯度外源添加，但在土壤中實(shí)際測定的酚酸含量通常低于該濃度，原因是田間土壤中微生物種類豐富，有益微生物能有效降解土壤中的酚酸類物質(zhì)，最終導(dǎo)致其含量降低。如 Li等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，在未滅菌土壤中外源添加170 mg·kg–1的苯甲酸后，土壤中的苯甲酸大約在7 d左右就全部被降解，表明通過根系分泌或殘?bào)w腐解等途徑進(jìn)入土壤中的酚酸含量一般是高于實(shí)測濃度的。本研究中外源添加了較土壤實(shí)測濃度高的阿魏酸并接種尖孢鐮刀菌，發(fā)現(xiàn)間作能夠有效減輕蠶豆枯萎病的危害。然而本研究中水培環(huán)境與土壤還存在很大的差異，阿魏酸在蠶豆連作障礙形成中的實(shí)際作用有待通過土培試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

阿魏酸脅迫一方面增加尖孢鐮刀菌分泌更高活性的細(xì)胞壁降解酶，促進(jìn)其對(duì)蠶豆根系細(xì)胞壁的降解，打破蠶豆根系的物理屏障，促進(jìn)尖孢鐮刀菌的定殖、傳播和癥狀的擴(kuò)展；另一方面阿魏酸還進(jìn)一步增加蠶豆根系中木質(zhì)素含量和胼胝質(zhì)沉積，加劇對(duì)蠶豆根系組織結(jié)構(gòu)的破壞，為尖孢鐮刀菌的入侵提供有利條件，降低蠶豆的抗性而促進(jìn)枯萎病發(fā)生。小麥與蠶豆間作可降低蠶豆根系細(xì)胞壁降解酶活性，提高蠶豆根系的木質(zhì)化程度，減少胼胝質(zhì)沉積，減輕導(dǎo)管堵塞，減緩細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等的消解，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，最終減輕蠶豆枯萎病的發(fā)生和危害，有效緩解蠶豆的連作障礙。表明小麥與蠶豆間作有利于細(xì)胞形成物理屏障，阻止病原菌的入侵，控制蠶豆枯萎病的發(fā)生，是克服蠶豆連作障礙的環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效方法。