阿布力克木·提力瓦爾迪，王旭光，艾合買提江·吐爾遜，吐爾遜別克·阿得力別克，熱比婭，麥地娜，阿布力孜·吾斯曼

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站）

冷凍保存對(duì)和田羊精液品質(zhì)的影響

阿布力克木·提力瓦爾迪1，王旭光1，艾合買提江·吐爾遜1，吐爾遜別克·阿得力別克2，熱比婭1，麥地娜1，阿布力孜·吾斯曼1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站）

對(duì)和田羊精液進(jìn)行冷凍保存，以比較冷凍對(duì)和田羊精子獲能、質(zhì)膜完整性和頂體完整率的影響。結(jié)果表明：①冷凍保存對(duì)綿羊精子獲能有一定的影響，解凍精子的獲能比新鮮精子的獲能數(shù)量顯著增多（P<0.05）。解凍過程使得顯示獲能的B型精子的數(shù)量顯著增加（P<0.05）。②冷凍使精子質(zhì)膜破損，致使解凍精子無論是在質(zhì)膜完整性還是在頂體完整率上都與新鮮精子存在較大差異，說明冷凍過程對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重?fù)p傷。

和田羊；精液檢查；冷凍保存；精子

和田羊是有悠久歷史的地方優(yōu)良品種，它是我國(guó)優(yōu)良的地毯毛地方品種，屬異質(zhì)半粗毛短脂尾綿羊品種，善于長(zhǎng)途跋涉覓食，有較強(qiáng)的抗病力。

綿羊精液的冷凍保存對(duì)于綿羊遺傳資源的長(zhǎng)期保存和輔助繁殖技術(shù)研究具有重要意義。準(zhǔn)確、客觀地評(píng)價(jià)精子的質(zhì)量和受精能力是人工授精和體外受精技術(shù)成功的關(guān)鍵［1］。

目前，精液品質(zhì)的主要檢測(cè)指標(biāo)有精液量、精子活力、精子密度、精子畸形率、頂體完整率、存活時(shí)間等。人們對(duì)精液品質(zhì)的檢測(cè)方法不斷改善，進(jìn)而對(duì)精液質(zhì)量的評(píng)價(jià)也相應(yīng)發(fā)生了變化，使得對(duì)冷凍-解凍后精液質(zhì)量的評(píng)定更加科學(xué)、準(zhǔn)確，以便于確切地反映精子的受精能力［2］。為此，本實(shí)驗(yàn)采用HOS-EY法和考馬斯亮藍(lán)染色法，研究了冷凍對(duì)和田羊精子獲能、質(zhì)膜完整性及頂體完整率的影響，以期為提高綿羊精液品質(zhì)提供可靠的科學(xué)依據(jù)，也為綿羊冷凍保存技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化鈉，三氨基甲烷，CTC染料，戊二醛，PBS試劑，香柏油，無色指甲油，甘油，考馬斯亮藍(lán)R-250，伊紅低滲液。

正置熒光顯微鏡，pH測(cè)儀，離心機(jī)，電子天平，計(jì)數(shù)板，顯微鏡。

精液稀釋液基礎(chǔ)液包含：葡萄糖，蔗糖，青霉素，鏈霉素，檸檬酸鈉（國(guó)產(chǎn)，化學(xué)純），新鮮卵黃。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集和要求 以2只體重相近、膘情中等、體質(zhì)健康正常、性欲旺盛、年齡在2～3歲的和田羊公羊作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。利用假陰道法采精。精液采出后，立即于37℃下常規(guī)品質(zhì)檢查，要求原精液無異味，色澤乳白色，云霧狀；原精液活力不低于0.8，密度為“密”級(jí)。

1.2.2 精液的稀釋和平衡 在精液常規(guī)品質(zhì)檢查完成后，將符合要求的新鮮精液根據(jù)活率和密度按1∶3～1∶4的比例稀釋。冷凍稀釋液與精液稀釋混勻后在室溫下，用0.25 mL的塑料細(xì)管分裝并封口，裹8～10層紗布置于4℃冰箱中平衡2～3 h。

1.2.3 精液的冷凍保存 將平衡好的細(xì)管精液置于自制裝有液氮的冷凍泡沫盒內(nèi)（細(xì)管精液距離液氮表面2.0～2.5 cm，溫度在-80～-110℃之間）熏蒸，5～7 min后投入液氮保存。

1.2.4 精液解凍 從液氮中取出細(xì)管精液，迅速平行地浸入39～40℃水浴中，輕輕搖動(dòng)至融化（10～15 s），即備使用。

1.3 精子品質(zhì)檢測(cè)方法

1.3.1 精子活率及密度檢測(cè) 將精液在37℃預(yù)熱后置于顯微鏡下，在400倍下觀察精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)并評(píng)定精子

活率，原精活率0.8以上方可使用。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子密度。

1.3.2 精子獲能測(cè)定 將100 μL新鮮原精分裝于離心管中，1 600 r/min離心5 min，進(jìn)行精液濃縮；而后加入約1.5 mL的PBS懸浮精子，1 600 r/min離心5 min，再洗滌2次，棄上清液。再加入1.5 mLPBS懸浮，取樣15 μL并加入CTC染液15 μL，懸浮20 s再加3%戊二醛3.6 μL，取樣10 μL滴到載玻片上，加蓋玻片后用無色指甲油封片觀察。精子獲能的判定：以CTC熒光染色法觀察精子獲能情況。經(jīng)CTC熒光染色后精子分為3種類型即B、F和AR型。B型精子為已獲能精子，其特點(diǎn)是頂體帽仍然存在，但在頂體后區(qū)出現(xiàn)一條暗淡的熒光區(qū)帶；F型為未獲能精子，其頂體帽完整，整個(gè)頂體布滿黃綠色熒光；AR型精子為頂體反應(yīng)精子，頂體帽缺少，整個(gè)精子頭部顯示淡綠色或無熒光，見圖1。

圖1 B、F、AR型精子示意圖

1.3.3 精子質(zhì)膜檢測(cè) 取新鮮或冷凍精液0.1 mL加入1 mL低滲液中，混勻，放37℃水浴后，再加入伊紅低滲液0.1 mL，混勻。2 min后取樣置于光鏡下觀察精子頭部著色和尾部腫脹情況，按以下4種精子類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算百分率。Ⅰ型為頭紅染（EY+）-尾不腫脹（HOS-）；Ⅱ型為頭紅染（EY+）-尾腫脹（HOS+）；Ⅲ型為頭未染（EY-）-尾不腫脹（HOS-）；Ⅳ型為頭未染（EY-）-尾腫脹（HOS+）?；诰宇^部和尾部的形態(tài)學(xué)變化，4種精子類型分別提示，Ⅰ型是頭膜和尾膜同時(shí)發(fā)生損傷的精子，Ⅱ型和Ⅲ型是膜損傷分別發(fā)生在頭部或尾部的過渡型，Ⅳ型是頭膜和尾膜都完整的活精子。

1.3.4 精子頂體檢測(cè) 取50 μL精子稀釋液加入1 mL 0.9%生理鹽水中，10 000 r/min離心15 s（所有離心均是這樣的標(biāo)準(zhǔn)）棄上清。加1 mL3.7%多聚甲醛／PBS后用加樣器懸浮，在室溫固定30 min，離心后棄上清。用500～800 μL懸浮后涂片，空氣干燥用0.22%考馬斯亮藍(lán)G-250染色5 min。蒸餾水洗去染色后，空氣干燥，進(jìn)行觀察。鏡檢200個(gè)以上精子。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：①Ⅰ型：頂體完整，精子外型正常，著色均勻，頂體邊緣整齊，有時(shí)可見清晰赤道板。②Ⅱ型：頂體經(jīng)微膨脹，精子質(zhì)膜疏松膨大。③Ⅲ型：頂體破壞，精子質(zhì)膜嚴(yán)重膨脹受損，著色淺，邊緣不整齊。④Ⅳ型：頂體完全脫落，精子核完全裸露。

計(jì)算公式：精子頂體完整率（%）=頂體完整精子數(shù)／200×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用EXCEL及SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，

P>0.05時(shí)差異不顯著；P<0.05時(shí)差異顯著,P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍前后精子獲能變化的比較

從表1可知，和田羊新鮮精子B型為41.5%，F(xiàn)型30.5%，AR型28.0%；而解凍精液則B型為56.0%，F(xiàn)型21.5%，AR型22.5%。由以上可以看出，解凍精液的B型精子的數(shù)量顯著增加（P<0.05）。

表1 冷凍前后精子獲能變化的比較

2.2 冷凍前后精子質(zhì)膜變化的比較

綿羊精液冷凍-解凍過程對(duì)精子質(zhì)膜完整性有嚴(yán)重影響。從表2可知，頭膜損傷-尾膜完整的Ⅱ型精子發(fā)生率在冷凍過程中從（21.01±1.15）%增加到（38.33± 5.69）%（P＜0.01），頭膜完整-尾膜損傷的Ⅲ型精子發(fā)生率從新鮮精液的（17.50±2.08）%減少到冷凍精液的（9.05±0.96）%（P＜0.05）。此外，在經(jīng)冷凍保存后，頭膜-尾膜均完整的Ⅳ型精子發(fā)生率和頭膜-尾膜均損傷的Ⅰ型精子發(fā)生率分別顯著減少和增多（P＜0.05）。

表2 冷凍前后精子質(zhì)膜變化的比較

2.3 冷凍前后精子頂體完整率變化比較

從表3可知，新鮮精液和冷凍精液組的精子頂體完整率分別為（76.20±7.66）%和（51.67±4.87）%。冷凍精液的頂體完整率和精子活率與冷凍前比較均顯著下降（P<0.05）。

表3 冷凍前后精子頂體完整率變化比較

3 討論

3.1 冷凍保存對(duì)綿羊精子獲能的影響

獲能并不能產(chǎn)生一個(gè)可區(qū)分及穩(wěn)定的激活狀態(tài)的細(xì)胞群體，而是一個(gè)連續(xù)的去穩(wěn)定的過程，最后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)達(dá)到不穩(wěn)定狀態(tài)的臨界水平時(shí)，精子展現(xiàn)出活動(dòng)過度的運(yùn)動(dòng)性并且對(duì)一個(gè)適當(dāng)?shù)男盘?hào)能做出反應(yīng)而發(fā)生頂體反應(yīng)，此點(diǎn)即可作為已獲能的標(biāo)志（陶勇等，1999）。獲能一旦開始，隨著膜功能漸進(jìn)性惡化，去穩(wěn)定的過程將會(huì)繼續(xù)超出臨界水平，直到精子不能夠維持細(xì)胞的完整性。

金霉素?zé)晒馊旧ǎ–TC）是根據(jù)精子不同獲能狀態(tài)進(jìn)行染色，并可將精子分為B、F和AR等3種CTC熒光染色類型，但對(duì)未獲能精子則沒染色［3］。由Gillan等［4］研究發(fā)現(xiàn)，羊鮮精為18%（B）、61%（F）和21%（AR），而解凍精液則有66%（B）、7.2%（F）和26%（AR），解凍過程使顯示獲能的B型精子的數(shù)量增加，但對(duì)頂體反應(yīng)的精子數(shù)量有很小的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：解凍過程使得顯示獲能的B型精子的數(shù)量增加，這一結(jié)果與Gillan等的研究結(jié)果基本一致，表明冷凍保存能誘導(dǎo)精子的獲能變化。

3.2 冷凍保存對(duì)綿羊精子質(zhì)膜完整性的影響

由于冷凍保存過程中的物理和化學(xué)效應(yīng)直接作用于精子質(zhì)膜和頂體完整率，導(dǎo)致精子質(zhì)膜的完整性不可避免地受到影響，因此闡明冷凍保存時(shí)精子質(zhì)膜的完整性和頂體完整率對(duì)于評(píng)價(jià)精液品質(zhì)有重要意義［5-6］。

吳裕倫等［7］用HOS-EY對(duì)人精子頭膜和尾膜完整性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)精子尾部腫脹率與精子活率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與精子死亡率呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，精子低溫冷凍時(shí)，由于精子內(nèi)外環(huán)境的劇烈改變，必然產(chǎn)生物理性或化學(xué)性的冷凍損傷。有關(guān)研究表明，當(dāng)精子活率越高、死亡率越低時(shí)，精子尾部低滲腫脹率越高，提示精子尾膜的完整性越好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：頭膜損傷-尾膜完整的Ⅱ型精子發(fā)生率在冷凍組極顯著增多（P＜0.01），提示精子頭部或尾部的冷凍損傷是獨(dú)立發(fā)生的，且頭膜較尾膜易損傷；4種類型新鮮精液的精子發(fā)生率與冷凍前相比均有顯著性差異（P<0.05），這表現(xiàn)在經(jīng)冷凍保存后，頭膜-尾膜均完整的Ⅳ型精子發(fā)生率比新鮮精液顯著減少。頭膜-尾膜均損傷的Ⅰ型精子發(fā)生率顯著增多。這與朱偉杰等［8］采用HOS-EY對(duì)人解凍精子質(zhì)膜完整性進(jìn)行檢測(cè)的研究結(jié)果相一致，這表明精子質(zhì)膜在冷凍保存過程中受到一定的損傷。

3.3 冷凍保存對(duì)綿羊精子頂體完整率的影響

頂體完整率是反映頂體缺陷與否的重要指標(biāo)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，即使是小卵形精子和梨形精子，只要其頂體形態(tài)正常，仍可以成功地與透明帶結(jié)合［9］。精子冷凍保存時(shí)精子經(jīng)歷與冷凍保護(hù)劑孵育、降溫冷凍、超低溫貯存和解凍復(fù)溫等過程，這些過程的化學(xué)和物理效應(yīng)直接作用于精子，精子頂體不可避免地受到影響。本研究結(jié)果表明，新鮮精液和冷凍精液組的精子頂體完整率分別為（76.20±7.66）%和（51.67±4.87）%，表明冷凍精液的頂體完整率顯著下降（P<0.05）。冷凍精液頂體完整率的降低與本實(shí)驗(yàn)使用的冷凍稀釋液成分、降溫速度、冷凍方法及解凍等有直接的關(guān)系。因此，在今后的綿羊精液冷凍過程中要特別注意以上因素，將冷凍過程對(duì)精子頂體的損傷程度降到最低，以提高冷凍精子頂體完整率。

4 小結(jié)

1）和田羊精子解凍后精子獲能比率比新鮮精子獲能比率高。解凍后獲能的B型精子的數(shù)量增加。

2）精液冷凍使和田羊精子質(zhì)膜破損，解凍后的精子無論是在質(zhì)膜完整性還是在頂體完整率上都與新鮮精子有顯著性差異。這說明冷凍過程對(duì)和田羊精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有較大的損傷作用。

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S826.3

A

2095-3887（2014）02-0019-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.006

2013-12-02

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（XJEDU2010I23）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160459）；新疆肉乳草食動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室資助

阿布力克木·提力瓦爾迪(1987-)，男，維吾爾族，碩士研究生。

阿布力孜·吾斯曼（1968-），男，維吾爾族，博士，副教授，碩導(dǎo)，從事動(dòng)物繁殖與胚胎生物技術(shù)研究。