褚 敏，焦 斐，吳曉云，閻 萍，梁春年，郭 憲，裴 杰，丁學(xué)智，包鵬甲，朱新書

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

牦牛FASN基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究

褚 敏1，2，焦 斐1，2，吳曉云1，2，閻 萍1，2，梁春年1，2，郭 憲1，2，裴 杰1，2，丁學(xué)智1，2，包鵬甲1，2，朱新書1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

利用PCR-SSCP技術(shù)，對甘南牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛的FASN基因第3內(nèi)含子進(jìn)行SNPs篩選，并將篩選到的突變位點(diǎn)與牦牛部分肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個牦牛群體在第3內(nèi)含子檢測到g.5477 C→T的突變，由此產(chǎn)生3種基因型：HH、HG、GG。相關(guān)性分析表明，HH基因型和HG基因型個體的脂肪含量顯著高于GG基因型個體（P<0.05）。HH、HG、GG 3種基因型對失水率、熟肉率、pH24值和剪切力的影響差異不顯著（P>0.05）。

牦牛；FASN基因；SNPs；肉質(zhì)性狀

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）是脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶。動物體脂沉積所需要的脂肪酸大多來自脂肪酸從頭合成，而脂肪酸的合成需要FASN催化乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和NADPH來實(shí)現(xiàn)［1-2］。FASN基因是體脂沉積性狀和肉質(zhì)性狀的重要候選基因［3-4］。近年來，國內(nèi)外研究者對脂肪酸生物合成途徑進(jìn)行了大量研究，初步闡明了脂肪酸合成的規(guī)律，尤其是對脂肪酸合成酶基因的表達(dá)進(jìn)行了探索性的研究［5］。相關(guān)研究表明，脂肪酸合成酶在哺乳動物肝臟和脂肪組織中表達(dá)［6］。脂肪酸合成酶基因（FASN）也已在一些動物中完成定位，人FASN基因定位于染色體17q25，鼠的定位于11號染色體，雞的定位于18號染色體，牛的定位于染色體19q22［4］。Chris等［7］通過連鎖分析對牛19號染色體上的QTL進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為FASN是這個QTL的候選基因，并檢測到了5個SNPs，通過相關(guān)分析結(jié)果表明：FASN基因的SNPs與脂肪和乳脂相關(guān)。RoyR等（2006）研究表明牛 FASN基因有多個 SNPs，其中Exon1g. 763G/C和Exon34g.16009 A/G突變改變了一個潛在的

SP1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致了蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼幔騿伪缎脱芯堪l(fā)現(xiàn)這些SNPs之間存在連鎖不平衡（P<0.01），并且認(rèn)為FASN基因是乳脂含量QTL的一個候選基因［5］。

牦牛廣泛分布于青藏高原及其周邊地帶，為當(dāng)?shù)靥峁┤?、乳、毛、皮等產(chǎn)品。牦牛肉肉質(zhì)鮮美，具有高蛋白、低脂肪、低熱量的特點(diǎn)，又因其生產(chǎn)于無現(xiàn)代工業(yè)污染的高寒草原，是地道的“綠色食品”，近年來深受消費(fèi)者青睞［8］。隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展和動物遺傳改良技術(shù)的不斷完善，在動物遺傳標(biāo)記輔助選擇中，遺傳標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用［9］。因此，利用生物學(xué)遺傳標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)牦牛的育種具有十分重要的意義。

本研究利用PCR-SSCP技術(shù)首次對中國3個牦牛群體脂肪酸合成酶基因進(jìn)行SNPs檢測，并將發(fā)現(xiàn)的SNPs與牦牛部分肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，旨在尋找與牦牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為牦牛分子育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本采集 試驗(yàn)共采集成年牦牛血樣341份，其中甘南牦牛98頭份、天祝白牦牛137頭份、大通牦牛106頭份，經(jīng)頸靜脈采血5 mL，ACD抗凝，4℃運(yùn)輸，帶回實(shí)驗(yàn)室后-70℃低溫保存。

1.1.2 試劑 TaqDNA polymerase、TaqPCR MasterMix、蛋白酶K、瓊脂糖、溴化乙錠、Tris飽和酚、DNAMarker均購自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 基因組DNA的提取

牦牛血樣基因組DNA的提取采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用紫外分光光度計(jì)測定濃度，-70℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照普通牛FASN基因全序列（GenBank登錄號AF285607.2）用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增牦牛FASN基因相應(yīng)區(qū)域（表1，只列出具有多態(tài)性的引物），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 牦牛FASN基因PCR擴(kuò)增的引物序列、目的片段長度及退火溫度

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為15μL，含5.7μL高壓滅菌水，7.5μL TaqPCR MasterMix，上下游引物各0.3 μL，TaqDNApolymerase 0.2 μL，模板DNA 1 μL；PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃60 s；退火溫度30 s（溫度見表1）；72℃50 s，共35個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物SSCP分析與測序

將4 μL PCR產(chǎn)物加入8 μL變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、0.01 mol/L EDTA、0.25%二甲苯氰FF、0.025%溴酚藍(lán)）中，98℃變性10 min，迅速冰浴10 min。加載于預(yù)制的10%聚丙烯酰胺凝膠中，以250 V電壓電泳10 min，再以200 V電壓電泳1.5 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶并記錄結(jié)果。經(jīng)SSCP分析后，將不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、檢測后送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件檢驗(yàn)各基因座位的基因型頻率和基因頻率。以廣義線性模型分析各基因座位和相關(guān)性狀間的關(guān)聯(lián)性，數(shù)學(xué)模型如下:

Yijk=μ+si+nj+mk+eijk

式中，Yijk：性狀測量值；μ：群體均值；si：性別效應(yīng)；nj：基因型效應(yīng)；mk：品種效應(yīng)；eijk：隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及SSCP分型

所得PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到355 bp一條特異性目的條帶（圖1）。由圖1可見，擴(kuò)增效果較好，可用于SSCP分析。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測，結(jié)果表明，F(xiàn)3B擴(kuò)增片段檢測到3種基因型，分別命名為HH、HG、GG（圖2）。

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 測序結(jié)果

將測序結(jié)果與GenBank中公布的普通牛FASN基因序列（AF285607.2）比對發(fā)現(xiàn)，第3內(nèi)含子檢測到g.5477C→T的突變，測序結(jié)果見圖3。

圖3 FASN基因內(nèi)含子3測序圖

2.3 FASN基因內(nèi)含子3的基因頻率和基因型頻率

甘南牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛3個群體FASN基因F3B位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在F3B位點(diǎn)處3個群體均表現(xiàn)出HG為優(yōu)勢基因型，HH型其次，GG型最弱，H等位基因是優(yōu)勢基因。在F3B位點(diǎn)甘南牦牛處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），天祝白牦牛、大通牦牛處于不平衡狀態(tài)（P<0.05），3個牦牛群體在F3B位點(diǎn)均處于中度多態(tài)。

表2 3個群體FASN基因內(nèi)含子3的基因頻率和基因型頻率

2.4 牦牛FASN基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀相關(guān)性

將F3B位點(diǎn)的3種基因型與肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。HH基因型和HG基因型個體的脂肪含量顯著高于GG基因型個體（P<0.05）。HH、HG、GG3種基因型對失水率、熟肉率、pH24值和剪切力的影響差異不顯著（P>0.05）。

表3 牦牛FASN基因不同基因型與肉質(zhì)性狀最小二乘分析

3 討論

FASN基因是影響動物體脂沉積性狀和肉質(zhì)性狀的重要候選基因。目前對該基因的研究多集中在多態(tài)性對牛肉、牛乳脂肪酸的影響，對牛肉脂肪及食用品質(zhì)影響的研究少見報(bào)道。Tsuyoshi Abe等［10］在日本黑牛FASN基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn) 8個 SNPs，其中 g.16024A>G和g.16039T>C兩個突變與C18∶0、C18∶1、C14∶0、C14∶1、C16∶0和 C16∶1的含量存在相關(guān)性。Chris等［7］在牛FASN基因中檢測到了5個多態(tài)位點(diǎn)，SNPs與3個牛群體的脂肪和乳脂性狀存在一定的相關(guān)性。侯玉潔等［11］在中國荷斯坦牛FASN基因第34外顯子發(fā)現(xiàn)一個g.16009 A/G的突變，該位點(diǎn)突變對短鏈脂肪酸相對含量有顯著影響，AA和AB基因型個體的短鏈脂肪酸相對含量顯著高于BB型。但至今未在牦牛中有任何關(guān)于該基因多態(tài)性的報(bào)道。

通過本次研究，在甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛FASN基因的第3內(nèi)含子檢測到g.5477 C→T的突變，發(fā)現(xiàn)該突變與牦牛肉脂肪含量存在顯著相關(guān)性。Dongyep Oh等（2011）在對韓國牛的FASN基因多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)g.16907 T→C突變與牛肉脂肪酸含量和大理石花紋有顯著相關(guān)性。在本研究中牦牛該位點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)突變，這可能由種間差異所造成。相關(guān)性分析表明，該突變與牦牛肉pH24值和脂肪含量有顯著相關(guān)性。預(yù)測這個突變有可能作為牦牛肉質(zhì)改良的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。

肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析表明，HH基因型和HG基因型個體的脂肪含量顯著高于GG基因型個體（P<0.05），由此看出，牦牛群體中H等位基因?qū)﹃笈Ｈ庵竞科鹫嫘?yīng)，HH、HG基因型個體在群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，這可能是由于牦牛群體在長期的人工選育過程中造成的。

本研究發(fā)現(xiàn)甘南牦牛在F3B位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），天祝白牦牛、大通牦牛處于不平衡狀態(tài)（P<0.05），主要原因可能是天祝白牦牛和大通牦牛受人工選擇育種的強(qiáng)度較大，牦牛群體在繁育過程中，由于公牦牛間的“優(yōu)勝序列”，打破了交配的隨機(jī)性，可能也是造成該基因座處于不平衡的原因。

本次研究結(jié)果結(jié)合Tsuyoshi Abe等［10］、Dongyep Oh等［12］的研究可推斷FASN基因不僅影響牛肉的脂肪酸組成及含量，亦影響牦牛肉的脂肪含量及食用品質(zhì)相關(guān)性狀。推測FASN基因可作為牦牛肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇的有效分子標(biāo)記，對內(nèi)含子3突變位點(diǎn)的相關(guān)性分析為進(jìn)一步開展牦牛肉質(zhì)性狀分子育種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為科研工作者的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

［1］顏新春，汪以真，許梓榮.動物脂肪酸合成酶（FAS）基因表達(dá)的調(diào)控［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2002，2（14）:1-4.

［2］Stuart S，Andrzej W，Anil K J.Structural and functional organization of the animal fattyacid synthase［J］.Eur J Biochem，1991，198:571-579.

［3］ZhangS，Knight T J，ReecyJ M，et al.DNA polymorphisms in bovine fatty acid synthase are associated with beef fatty acid composition［J］.Animal Genetics，2008，39（1）:62-70.

［4］Roy R，Taourit S，Zaragoza P，et al.Genomic structure and alternative transcript ofbovine fattyacid synthase gene（FASN）：comparative analysis oftheFASNgenebetweenmonogastricandruminantspecies［J］.Cytogenetic and Genome Research，2005，111:65-73.

［5］Roy R，Ordovas L，Zaragoza P，et al.Association of polymorphisms in the bovine FASN gene with milk-fat content［J］.Anim Genet，2006，37（3）：215-218.

［6］孟冬梅，王繼文，李亞峰.脂肪酸合成酶基因的研究進(jìn)展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004（1）:12-14.

［7］Chris A，Morris，Neil G，et al.Fattyacid synthase effects on bovine adipose fat and milk fat［J］.Mammalian Genome，2007，18:64-74.

［8］閻萍，梁春年，郭憲，等.中國牦牛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對策［C］//2009中國牛業(yè)進(jìn)展.2009：215-218.

［9］閆雷，林家棟，張曉杰，等.單核苷酸多態(tài)性在豬育種中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（6）:94-98.

［10］Tsuyoshi Abe，Junich Saburi，Hiroyuki Hasebe，et al.Novel mutations of the FASN gene and their effect on fatty acid composition in Japanese Black Beef［J］.BiochemGenet，2009，47:397-411.

［11］侯玉潔，常玲玲，冒海赟.中國荷斯坦牛FASN基因單核苷酸多態(tài)性對脂肪酸含量的影響［J］.中國奶牛，2011（18）:1-4.

［12］DongyepOh，YoonseokLee，BoomiLa，etal.Fattyacidcompositionofbeef is associated with exonic nucleotide variants of the gene encoding FASN［J］.Molecular BiologyReports，2011，20（7）：111-118.

Association between Polymorphism of FASN Gene and Meat Quality Traits in Yak

Chu Min1，2，JiaoFei1，2，Yan Ping1，2，et al
（1.Lanzhou Institute ofHusbandryand Pharmaceutical Sciences ofCAAS，Lanzhou 730050，China；2.KeyLaboratoryofYak BreedingEngineering，Lanzhou 730050，China）

The polymorphisms on complete intron 3 of FASN gene were detected in three yak breeds including Gannan yak，Datongyak and Tianzhu White yak byPCR-SSCP，and the association between the polymorphisms and meat qualitytraits were analyzed.One polymorphism C→T in 5 477 bp was found.Three genotypes named HH，HG and GG were caused by this mutation. Correlation analysis showed that yaks with HH genotype and HGgenotype had significantlyhigher fattycontent than the GGgenotype（P<0.05）.There were nosignificant difference amongthree genotypes on water loss，cooked meat percentage，pH24and shear force（P>0.05）.

yak；FASN gene；SNPs；meat qualitytraits

S823.8+5

A

2095-3887（2014）01-0017-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.004

2013-11-25

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-382）；公益行業(yè)農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)（201003061）；甘南牦牛藏羊良種繁育基地建設(shè)及健康養(yǎng)殖技術(shù)集成示范（1102NKDA027）

褚敏（1982-），女，助理研究員，碩士。

閻萍（1963-），研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事牦牛遺傳育種與繁殖研究。