朱軍偉，杭 鋒，王欽博，宋 馨，侯建平

(光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海200436)

傳統(tǒng)的定量檢測方法依靠特定的微生物培養(yǎng)基對食品中活菌進行分離和計數，測試過程需進行培養(yǎng)基準備、平板培養(yǎng)、菌落計數、生化鑒定等步驟，所以整個檢測顯得復雜、費時［1-2］。當前食品中病原菌的分子生物學檢測方法已極大縮短了獲得檢測結果的時間，這既能保證食品工業(yè)的產能提速，同時又能保持其所有食品安全要求。如今，基于聚合酶鏈反應方法檢測食源性微生物病原菌已經獲得了國際標準化組織(ISO)認可［3-5］。

傳統(tǒng)的微生物方法無法檢測一些有活性但很難培養(yǎng)的微生物，而分子生物學方法卻能實現。此外，最新的分子生物學方法利用熒光染料特異性摻入DNA雙鏈，可以準確地計算活性微生物菌群的數量。

在乳品工業(yè)中，微生物技術常被應用于食源性病原菌的檢測和有益微生物如發(fā)酵微生物、益生菌的定量。由于益生菌和乳酸菌在乳制品中同時存在，如何準確地計數每種益生菌和乳酸菌的數量給乳品工業(yè)帶來了一個巨大挑戰(zhàn)。乳品微生物學需要具有高鑒別能力的方法，進而量化諸如乳制品和糞便等復雜系統(tǒng)中的益生菌數量，并追蹤其在食物鏈中存活能力的相關信息。因此，國內外研究人員正在研究基于PCR的分子學方法以期能準確定量活菌數量，還可以在單一反應體系中檢測多個微生物數量，且能構建高通量PCR流程［6-8］。目前，該方法已經取得了一些進展，筆者就實時熒光定量PCR技術在乳品微生物學中的最新研究進行了綜述，并對其作用機理進行闡述，期望能給實時熒光定量PCR技術在乳品工業(yè)中的推廣使用提供一定的理論支持。

1 實時熒光定量PCR概述

1.1 實時熒光定量PCR的基本原理 實時熒光定量PCR(real-time fluomgenetic quantitative PCR)是在PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團(染料或探針)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［8-10］。

熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物增加完全同步。熒光探針是在探針的5＇端標記一個熒光報告基團(R)，3＇端標記一個淬滅基團(Q)，兩者可構成能量傳遞結構，即5＇端熒光報告基團所發(fā)出的熒光可被3＇端淬滅基團吸收或抑制，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可收到熒光信號。

定量的原理:靶基因初始拷貝數越多，所產生的循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)越小。這里有2個問題需要明確:①熒光閾值的設定。在定量PCR中，需要經過數個循環(huán)后熒光信號才能夠被檢測到，一般以前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。②CT值為PCR過程中擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環(huán)次數。根據熒光產生的原理，可將實時熒光定量PCR分為不同類型［9-10］(表1)。

1.2 實時熒光定量PCR的特點 實時熒光定量PCR技術與傳統(tǒng)定量PCR技術相比，具有以下優(yōu)點［11］:①實時定量PCR不需要PCR后處理，所以可避免PCR的實驗室污染，大大減少因交叉污染引起的假陽性錯誤。②可用β-actin基因序列對樣本的擴增效率進行標化。在產物積聚的對數期進行實時分析，允許對多種不同的基因進行同時分析，而不必考慮“平臺效應”對試驗結果的影響。③節(jié)省了PCR后處理的時間，樣本通量大大提高。④實時定量PCR無需內標，具有高度重復性，可對每個樣本進行重復擴增以減少潛在錯誤。⑤實時定量PCR有很大的動力學范圍(接近1×106)，用標準曲線對靶序列進行檢測時，可對任何未知樣本進行定量，循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)和相關的DNA模板拷貝數呈線性相關。

另外，實時定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量PCR只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在計算機軟件之中，通過對每個樣品循環(huán)閾值的計算，根據標準曲線獲得定量結果［12-16］。

表1 實時熒光定量PCR技術分類

2 實時熒光定量PCR在乳品微生物學中的應用研究進展

2.1 實時熒光定量PCR在益生菌檢測中的應用 根據世界衛(wèi)生組織(WHO)對益生菌的定義［17］，它是指一類活的微生物，當攝入一定數量時，對宿主的健康有益。益生菌對宿主健康的積極作用還和其應用劑量緊密相關。宿主體內益生菌數量極其重要，那么要保證其劑量，就需要保證產品貨架期內益生菌的存活數量及其在宿主腸道內的存活量;與此同時，益生菌也可在宿主回腸末端或大腸中自行繁殖到足夠劑量，從而發(fā)揮益生作用。

幾項研究結果表明，使用一些發(fā)酵微生物作為發(fā)酵乳中的益生菌在預防和治療某些疾病方面呈現出顯著有益的臨床效應。Heyman等研究表明，益生菌對于預防和治療腹瀉效果明顯［18］。Mustapha等研究表明，益生菌的存在可以改善乳糖不耐癥患者對于乳糖的消化［19］。益生菌在預防和治療過敏性、炎癥性腸病中能發(fā)揮積極作用［20-21］。

益生菌鑒定和計數的傳統(tǒng)方法是通過生化、形態(tài)學及選擇性培養(yǎng)等方法進而區(qū)分不同益生菌的表型特征［22］。

隨著雙歧桿菌在益生菌產品中的廣泛使用，建立一種快速的定性且定量檢測市售產品中雙歧桿菌的方法顯得極其重要。最新的一些研究成果表明，實時熒光定量PCR技術為乳品中發(fā)酵微生物和益生菌的定量檢測提供了全新的方法，從而減少檢測時間與勞力消耗［23］。

王立平等建立了發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌種類和數量快速測定方法［24］。以發(fā)酵乳中雙歧桿菌為靶標，采用PCRDGGE技術快速識別雙歧桿菌種類;采用實時熒光定量PCR手段測定雙歧桿菌數量。研究結果表明，PCR-DGGE能準確、快速鑒別雙歧桿菌種類，檢出限為105CFU/g;實時熒光定量PCR能準確、快速定量雙歧桿菌，檢出限為104CFU/g。該方法可用于發(fā)酵乳中雙歧桿菌的快速識別和定量。

Masco等以16s rDNA或recA為目標基因分別設計引物，再進行實時熒光定量PCR分析，對29種益生菌產品中的雙歧桿菌進行了定量檢測［25］。2種實時定量PCR方法都很快速，且定量結果都很相近，只有在檢測含益生菌較少的產品時，以16s rDNA為目標基因的定量更為靈敏。

Sheu等以tuf為目標基因設計引物進行實時PCR反應，能有效地檢測到益生菌產品中的雙歧桿菌;此外，還能檢測到存活的雙歧桿菌數量以及原有雙歧桿菌總數量，與平板計數法所得數目基本一致［26］。此研究為檢查益生菌產品的質量提供了一種行之有效的方法。

Herbel等以hsp60為目標基因設計引物建立實時熒光定量PCR流程以檢測酸奶中5種重要的益生乳桿菌屬［27］。通過此法的最低檢測限為105CFU/ml，這對于市售酸奶制品來說已經是相當高效。因此，通過合理設計引物建立實時熒光定量PCR可以更準確、快速和靈敏地檢測和定量市售產品中益生菌含量。

García等建立了一種核酸染料 propidium monoazide(PMA)與定量PCR技術聯(lián)合選擇性檢測發(fā)酵乳制品中活性乳酸菌和雙歧桿菌的技術(PMA-qPCR)［28］。結果表明，PMA-qPCR技術既能夠有效區(qū)分活性菌與非活性菌，又能區(qū)別活性乳酸菌和活性雙歧桿菌，同時還能快速有效地計數2種活性菌的數量。與平板計數法相比，檢測時間由72 h縮短至3 h左右。

Desfossés等首度通過PMA-qPCR技術監(jiān)測切達干酪制作以及成熟過程中益生菌菌群(主要分析植物乳桿菌和雙歧桿菌)的存活性能［29］。結果表明，與傳統(tǒng)分子技術相比，PMA-qPCR技術更具特異性和準確性。

因此，PMA-qPCR技術在發(fā)酵乳制品或者干酪中益生菌的鑒定和定量中具有廣闊的應用前景。

2.2 實時熒光定量PCR在發(fā)酵乳制品乳酸菌檢測中的應用 Sheu等通過tuf基因設計引物開發(fā)了多重非定量PCR技術，可以用于同時檢測市售乳制品中嗜乳酸桿菌、干酪乳桿菌群、德氏乳桿菌以及長雙歧桿菌［30］。然而，很少有研究報道如何既能檢測乳制品中乳酸菌又能對其進行定量。

Furet等開發(fā)并評估了一種實時熒光定量PCR技術應用于特異性檢測和定量市售發(fā)酵乳制品中乳酸菌菌群(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、約氏乳酸桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的數量，并與傳統(tǒng)平板計數法進行比較［31］。結果表明，實時熒光定量PCR不僅可以鑒定發(fā)酵乳制品原有的乳酸菌菌群種類，還可以準確地定量各不同菌群的菌體數量。

吳榮榮等采用實時熒光定量PCR分析了酸乳中的德氏乳桿菌L2和嗜熱鏈球菌S1的數量［32］，德氏乳桿菌L2的活菌數與細胞循環(huán)數的相互關系曲線為Y=-2.936logX+34.72(R2=0.998)，采用平板計數法獲得的樣品中L2濃度為8.82×108ml，熒光定量的結果是8.78×108ml;嗜熱鏈球菌S1活菌數與細胞循環(huán)數的相互關系曲線為Y=-3.039logX+35.45(R2=0.995)，采用平板計數法，獲得的樣品中嗜熱鏈球菌S1濃度1.08×108ml，熒光定量的結果是1.06×108ml。實時熒光定量的方法適合于酸乳中乳酸菌的快速計數。

2.3 實時熒光定量PCR在干酪制品微生物檢測中的應用 在干酪的成熟過程中，參與發(fā)酵過程的有益微生物對于最終成品干酪的風味品質尤為重要。由于缺少可供選擇的媒介，量化干酪表面的細菌非常困難，因此干酪表面的微生物菌群生態(tài)系統(tǒng)還得不到廣泛研究。

Monnet等開發(fā)了SYBR Green I實時熒光PCR方法用來定量市售涂抹型干酪上的干酪棒狀桿菌［33］。此方法有助于研究涂抹型干酪的生態(tài)系統(tǒng)以及干酪棒狀桿菌的功能特性。

卡門培爾青霉和婁地青霉在霉菌表面成熟干酪和藍紋干酪的成熟過程中起到了至關重要的作用。G.Le Dréan等開發(fā)了qRT-PCR技術，為干酪生產廠家提供了一種簡便且靈敏的檢測方法，即通過卡門培爾青霉和婁地青霉的成長動力學，進而很好地理解微生物變化與生物化學變化兩者之間的關系［34］。

Ladero等利用高效液相色譜法(HPLC)和實時熒光定量PCR技術對不同市售干酪中組胺及組胺產生的細菌含量分別進行了分析測定［35］。即使在干酪的生產過程中，利用實時熒光定量PCR技術可以在組胺水平積累到不可接受程度之前檢測到組胺產生菌株的含量，這就能有效解決高效液相色譜法只能檢測干酪中組胺含量而不能檢測產生組胺的細菌數量的問題。

Achilleos等以tuf為目標基因開發(fā)了2種實時熒光定量PCR方法來定量研究干酪樣品中乳酸乳球菌和副干酪乳桿菌2種菌群的數量［36］。結果表明，此方法能極為有效地定量干酪中乳酸乳球菌菌群的數量，而對于副干酪乳桿菌菌群的計數卻無法達到理想效果。

Zago等以pheS為目標基因開發(fā)了一種實時熒光定量PCR方法來特異性檢測定量干酪中的一類有益微生物——灰黃色腸球菌(Enterococcus gilvus)，其檢測限可達到104CFU/g［37］。此方法有助于檢測和定量干酪中的灰黃色腸球菌，進而更好地理解其在干酪以及其他發(fā)酵食品中所起到的技術作用和安全性作用。

Martín等以 lacZ為目標基因設計引物，基于 SYBR Green I建立實時熒光定量PCR流程來定量檢測干酪中的所有大腸菌群，且整個流程僅需花費10～12 h［38］。

3 小結與展望

該研究中所提到的大多數研究案例以及最新的研究進展說明實時熒光定量PCR技術在乳品微生物學中的應用才剛剛起步，許多國內外學者正致力于其廣泛應用。未來在這一領域的發(fā)展是希望通過此技術能夠給乳品工業(yè)化過程中微生物風險評估提供有利的信息。當然，實時熒光定量PCR技術的發(fā)展，不能與其他傳統(tǒng)和分子學方法相脫離，而應該與他們結合起來以實現優(yōu)勢互補。

［1］VALASEK M A，REPA J J.The power of real-time PCR［J］.Advances in Physiology Education，2005，29(3):151-159.

［2］MACKAY I M.Real-time PCR in the microbiology laboratory［J］.Clinical Microbiology and Infection，2004，10(3):190-212.

［3］ISO22174:2005.Microbiology of food and animal feeding stuffs.Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens:General requirements and definitions［S］.2005.

［4］ISO20837:2006.Microbiology of food and animal feeding stuffs.Polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens:Requirements for sample preparation for qualitative detection［S］.2006.

［5］ISO22119:2010.Microbiology of food and animal feeding stuffs.Real-time polymerase chain reaction(PCR)for the detection of food-borne pathogens:General requirements and definitions［S］.2010.

［6］NOCKER A，CHEUNG C Y，CAMPER A K.Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs.dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells［J］.Journal of Microbiological Methods，2006，67(2):310-320.

［7］NOCKER A，SOSSA-FERNANDEZ P，BURR M D，et al.Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(16):5111-5117.

［8］趙文靜，徐潔，包秋華，等.實時熒光定量PCR中內參基因的選擇［J］.微生物學通報，2010，37(12):1825-1829.

［9］紀冬，辛紹杰.實時熒光定量PCR的發(fā)展和數據分析［J］.生物技術通訊，2009，20(4):598-600.

［10］AHMAD A I，GHASEMI J B.New FRET primers for quantitative realtime PCR［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387(8):2737-2743.

［11］裴曉燕，劉秀梅.食源性致病菌定量檢測方法研究進展［J］.國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊，2004，31(5):257-264.

［12］HEID C A，STEVENS J，LIVAK K J，et al.Real time quantitative PCR［J］.Genome Research，1996，6(10):986-994.

［13］BATT C A.Molecular diagnostics for dairy-borne pathogens［J］.Journal of Dairy Science，1997，80(1):220-229.

［14］GIBSON U，HEID C A，WILLIAMS P M.A novel method for real time quantitative RT-PCR［J］.Genome Research，1996，6(10):995-1001.

［15］LI W，DRAKE M A.Development of a quantitative competitive PCR assay for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 Cells［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(7):3291-3294.

［16］NOGVA H K，RUDI K，NATERSTAD K，et al.Application of 5＇-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures，water，skim milk，and unpasteurized whole milk［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(10):4266-4271.

［17］Joint FAO/WHO Working Group.Guidelines for the evaluation of probiotics in food［R］.2002.

［18］HEYMAN M，MéNARD S.Probiotic microorganisms:how they affect intestinal pathophysiology［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2002，59(7):1151-1165.

［19］MUSTAPHA A，JIANG T，SAVAIANO D A.Improvement of Lactose Digestion by Humans Following Ingestion of Unfermented Acidophilus Milk:Influence of Bile Sensitivity，Lactose Transport，and Acid Tolerance of Lactobacillus acidophilus［J］.Journal of Dairy Science，1997，80(8):1537-1545.

［20］KALLIOM?KI M，SALMINEN S，ARVILOMMI H，et al.Probiotics in primary prevention of atopic disease:a randomised placebo-controlled trial［J］.The Lancet，2001，357(9262):1076-1079.

［21］GIONCHETTI P，RIZZELLO F，VENTURI A，et al.Oral bacteriotherapy as maintenance treatment in patients with chronic pouchitis:a double-blind，placebo-controlled trial［J］.Gastroenterology，2000，119(2):305-309.

［22］CHARTERIS W P，KELLY P M，MORELLI L，et al.Selective detection，enumeration and identification of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in mixed bacterial populations［J］.International Journal of Food Microbiology，1997，35(1):1-27.

［23］FALENTIN H，POSTOLLEC F，PARAYRE S，et al.Specific metabolic activity of ripening bacteria quantified by real-time reverse transcription PCR throughout Emmental cheese manufacture［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，144(1):10-19.

［24］王立平，劉曉莉，蔡雪鳳，等.發(fā)酵乳活性雙歧桿菌種類快速識別及定量研究［J］.現代食品科技，2013，29(4):858-862.

［25］MASCO L，VANHOUTTE T，TEMMERMAN R，et al.Evaluation of realtime PCR targeting the 16S rRNA and recA genes for the enumeration of bifidobacteria in probiotic products［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，113(3):351-357.

［26］SHEU S J，HWANG W Z，CHIANG Y C，et al.Use of Tuf Gene-Based Primers for the PCR Detection of Probiotic Bifidobacterium Species and Enumeration of Bifidobacteria in Fermented Milk by Cultural and Quantitative Real-Time PCR Methods［J］.Journal of Food Science，2010，75(8):521-527.

［27］HERBEL S R，LAUZAT B，NICKISCH-ROSENEGK M，et al.Species-specific quantification of probiotic lactobacilli in yoghurt by quantitative realtime PCR［J］.Journal of Applied Microbiology，2013，115(6):1402-1410.

［28］GARCíA-CAYUELA T，TABASCO R，PELáEZ C，et al.Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bifidobacteria in fermented milk by using propidium monoazide and real-time PCR［J］.International Dairy Journal，2009，19(6):405-409.

［29］DESFOSSéS-FOUCAULT é，DUSSAULT-LEPAGE V，LE BOUCHER C，et al.Assessment of probiotic viability during Cheddar cheese manufacture and ripening using propidium monoazide-PCR quantification［J］.Frontiers in Microbiology，2012，3:350.

［30］SHEU S J，HWANG W Z，CHEN H C，et al.Development and use of tuf gene-based primers for the multiplex PCR detection of Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus casei group，Lactobacillus delbrueckii，and Bifidobacterium longum in commercial dairy products［J］.Journal of Food Protection，2009，72(1):93-100.

［31］FURET J P，QUéNéE P，TAILLIEZ P.Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，97(2):197-207.

［32］吳榮榮，劉海鵬，王敏，等.酸乳中乳桿菌和鏈球菌的實時熒光定量分析［J］.中國乳品工業(yè)，2010(8):38-40.

［33］MONNET C，CORREIA K，SARTHOU A S，et al.Quantitative detection of Corynebacterium casei in cheese by real-time PCR［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(11):6972-6979.

［34］LE DRéAN G，MOUNIER J，VASSEUR V，et al.Quantification of Penicillium camemberti and P.roqueforti mycelium by real-time PCR to assess their growth dynamics during ripening cheese［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，138(1):100-107.

［35］LADERO V，LINARES D M，FERNáNDEZ M，et al.Real time quantitative PCR detection of histamine-producing lactic acid bacteria in cheese:Relation with histamine content［J］.Food Research International，2008，41(10):1015-1019.

［36］ACHILLEOS C，BERTHIER F.Quantitative PCR for the specific quantification of Lactococcus lactis and Lactobacillus paracasei and its interest for Lactococcus lactis in cheese samples［J］.Food Microbiology，2013，36(2):286-295.

［37］ZAGO M，BONVINI B，CARMINATI D，et al.Detection and quantification of Enterococcus gilvus in cheese by real-time PCR［J］.Systematic and Applied Microbiology，2009，32(7):514-521.

［38］MARTíN M C，MARTíNEZ N，DEL RIO B，et al.A novel real-time polymerase chain reaction-based method for the detection and quantification of lactose-fermenting Enterobacteriaceae in the dairy and other food industries［J］.Journal of Dairy Science，2010，93(3):860-867.