王藝芳 劉奔 劉純青 鄭翔宇 劉丹丹 朱杰 楊春輝 孟秀香

1.河南省紅十字血液中心檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450012；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116044；4.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116027

Bmi-1-siRNA抑制肺腺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖及其機(jī)制

王藝芳1,2 劉奔3 劉純青2 鄭翔宇2 劉丹丹3 朱杰4 楊春輝4 孟秀香2

1.河南省紅十字血液中心檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450012；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116044；4.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116027

背景與目的：Bmi-1(B-cell specific moloneymurine leukemiavirus insertion site 1)基因是多梳基因家族的重要成員之一，主要通過調(diào)控INK4a/ARF位點(diǎn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和衰老。本研究旨在探討B(tài)mi-1-siRNA對(duì)具有INK4a/ARF位點(diǎn)的肺腺癌SPC-A1細(xì)胞生長和增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：①本實(shí)驗(yàn)選用已確定有效的siRNA序列進(jìn)行病毒包裝，構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒si-Bmi-1 pSUPERretro-neo，然后感染到SPC-A1細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)Bmi-1-siRNA的肺癌細(xì)胞株。②利用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)技術(shù)分析Bmi-1基因在Bmi-1-siRNA轉(zhuǎn)染后SPC-A1細(xì)胞中表達(dá)情況。③利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法、MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠實(shí)驗(yàn)，分析Bmi-1-siRNA對(duì)SPC-A1細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力的影響。④利用流式細(xì)胞術(shù)分析SPC-A1各組細(xì)胞的周期分布。⑤利用Western blot法分析增殖通路相關(guān)分子：p16INK4a、p53、Cyclin D1、PTEN和Ser473p-Akt等蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Bmi-1-siRNA被轉(zhuǎn)染后，有效抑制了SPC-A1細(xì)胞中Bmi-1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制了SPC-A1細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力(P＜0.01)，并使轉(zhuǎn)染組細(xì)胞阻滯在G1期［(64.6±1.2)%，P＜0.05］。沉默Bmi-1基因后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，p16INK4a、p53和Akt蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)，Cyclin D1和Ser473 p-Akt表達(dá)水平下降(P＜0.01)，PTEN表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.01)。用PTEN抑制劑處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞后，Bmi-1和Ser473 p-Akt蛋白表達(dá)得以重塑。結(jié)論：Bmi-1-siRNA通過將肺腺癌SPC-A1細(xì)胞周期阻滯于G1期來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這種抑制作用可能不依賴于p16INK4a來調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖。

Bmi-1基因；肺腺癌；細(xì)胞增殖

Bmi-1(B-cell specific moloneymurine leukemiavirus insertion site 1)基因是多疏基因家族(polycomb group gene)的重要調(diào)節(jié)基因之一。Bmi-1基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和衰老主要是通過其下游經(jīng)典位點(diǎn)INK4a/ARF來發(fā)揮作用［1］。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉默Bmi-1基因的表達(dá)能明顯抑制INK4a位點(diǎn)缺失的A549肺腺癌細(xì)胞的增殖及體內(nèi)致瘤能力［2-3］。為進(jìn)一步明確Bmi-1基因與肺腺癌生長和增殖的關(guān)系，我們選用了具有INK4a位點(diǎn)的SPC-A1肺腺癌細(xì)胞，分析沉默Bmi-1的表達(dá)對(duì)具有INK4a/ARF位點(diǎn)的肺腺癌細(xì)胞生長和增殖能力的影響，并探討其作用機(jī)制是否和經(jīng)典靶位有關(guān)，是否還有其他靶位？旨在為肺癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)GenBank中的Bmi-1 mRNA序列 (NM-005180)，設(shè)計(jì)了4條Bmi-1 siRNA序列和1條陰性對(duì)照序列，根據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1號(hào)序列干擾效果最好，所以本次實(shí)驗(yàn)選用1號(hào)序列作為siRNA的靶序列。Sh-BMI1 pSUPERretro-neo克隆序列如下，Target：5’-CAAGCAGAAATGCATCGAA-3’； Sh-BMI1順義鏈：5’-GATCCCCGCAAGCAGAAATGC ATCGAATTCAAGAGATTCGATGCATT TCTGCTTGCTTTTTA-3’；Sh-5’-AGCTTABMI1反義鏈：A A A A G C A A G C A G A A A T G C A T C G A A T C T C T T G A A T T C G A T G CATTTCTGCTTGCGGG-3’。Sh-BMI1-ctrpSUPERretro-neo克隆序列如下，Target：5’-CAGAGACTAGACAACATAG-3’；Sh-BMI1順義鏈(ctr)：5’-GATCCCCG C A G A G A C T A G A C A A C A T A G T T C A A G A G A C T A T G T T G T C T A G T C T C T G C T T T T T A-3’；S h-B M I 1反義鏈(ctr)：5’-AGCTTAAAAAGCAGAGACTA GACAACATAGTCTCTTGAACTATGTT GTCTAGTCTCTGCGGG-3’。選擇用BglⅡ和HindⅢ雙酶切shRNA表達(dá)載體pSUPERretro-neo，載體大小7 641 bp，同時(shí)使用EGFP綠色熒光蛋白作為標(biāo)志蛋白，具有G418抗性。構(gòu)建重組反轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達(dá)載體質(zhì)量組載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建交由廣州博川公司操作。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為SPC-A1-wt，轉(zhuǎn)染pSUPER-retro-neo-Bmi-1和陰性對(duì)照序列的分別命名為SPC-A1-Bmi-1-siRNA和SPC-A1-ctr細(xì)胞。

1.2 RT-PCR檢測

用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA后，按照寶生物工程(大連)有限公司TaKaRa RNA PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。引物序列如下：Bmi-1基因上游引物5’-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3’；Bmi-1基因

下游引物5’-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3’；以GAPDH作為內(nèi)參照基因，GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’；GAPDH下游引物：5’-GAAGATGGTGA TGGGATTTC-3’；PCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。最后用2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

收獲SPC-A1細(xì)胞提取總蛋白并進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。顯影定影后用凝膠成像分析儀掃描膠片上的條帶，運(yùn)用灰度分析軟件(Gel-Pro analyzer)讀取相對(duì)積分光密度作為條帶的強(qiáng)度指標(biāo)并進(jìn)行分析，用β-actin蛋白進(jìn)行組間校正。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞存活率檢測

用0.04%臺(tái)盼藍(lán)分別對(duì)3組SPC-A1細(xì)胞進(jìn)行染色，光鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)(其中著色細(xì)胞為死細(xì)胞)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，并計(jì)算存活率。存活率(%)=［(100-死細(xì)胞數(shù))/100］×100%。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

按每孔加5×103個(gè)細(xì)胞將3組細(xì)胞分別接種于96孔板培養(yǎng)細(xì)胞板，每組設(shè)5個(gè)平行孔。置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%溫箱中培養(yǎng)。每天取一塊板于酶標(biāo)儀492 nm處讀取各孔吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長曲線。連續(xù)測5 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 平板克隆法測定細(xì)胞的集落形成能力

于6孔板每孔中加入300個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d，待細(xì)胞形成克隆后，用10%甲醛固定20 min，再用結(jié)晶紫染液染15 min，自來水沖洗干凈。風(fēng)干后用數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)數(shù)肉眼可見的集落數(shù)目。

1.7 體內(nèi)成瘤

收獲SPC-A1細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107/mL。將18只裸鼠隨機(jī)分為3組，每組裸鼠單側(cè)前肢腋窩皮下注射一組SPC-A1細(xì)胞懸液150 μL。每天觀察裸鼠的一般狀況和腫瘤生長情況。4周后頸椎脫臼法處死裸鼠，分離出瘤塊稱重并拍照。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集1×106個(gè)細(xì)胞，用70%乙醇輕輕混勻，4 ℃固定24 h。檢測前用冷PBS洗兩次，加入RNaseA 37 ℃反應(yīng)1 h。加入碘化丙啶溶液避光染色1 h后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，用ModFit LT for Maclntel軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 13.0軟件完成，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用表示。主要方法為單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1基因沉默對(duì)SPC-A1細(xì)胞表達(dá)Bmi-1的影響

反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選的SPC-A1細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果顯示，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無熒光細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染組幾乎全部為熒光細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Bmi-1-siRNA后，與SPC-A1-ctr (mRNA表達(dá) 0.11±0.02；蛋白表達(dá)1.29±0.17)和SPC-A1-wt(mRNA表達(dá) 0.12±0.01；蛋白表達(dá)1.32±0.13)兩組細(xì)胞相比，SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞中Bmi-1的mRNA(0.02±0.01)和蛋白表達(dá)量(0.38±0.26)明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。而SPC-A1-ctr和SPC-A1-wt兩組細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

2.2 Bmi-1基因沉默對(duì)SPC-A1細(xì)胞體外增殖的影響

用0.04%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)SPC-A1細(xì)胞進(jìn)行染色后，計(jì)算細(xì)胞的存活率(圖2A)：3組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MTT法檢測細(xì)胞的增殖活力，細(xì)胞生長曲線顯示：與SPC-A1-ctr和SPC-A1-wt兩組細(xì)胞相比，SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞在第3天及以后的時(shí)間點(diǎn)A值降低，生長速度明顯緩慢(P＜0.05，圖2B)；而后兩組細(xì)胞的生長數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)10 d后形成克隆后，經(jīng)結(jié)晶紫染色，用數(shù)碼相機(jī)拍照。計(jì)數(shù)肉眼可見的集落數(shù)目，

結(jié)果顯示：接種SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞的集落數(shù)目為(9.3±1.5)個(gè)/視野，與接種SPCA1-ctr［(343.0±7.0)個(gè)/視野］和SPC-A1-wt［(353.7±6.0)個(gè)/視野］細(xì)胞的集落數(shù)目相比顯著降低(P＜0.01)；而SPC-A1-ctr 和SPC-A1-wt2組間細(xì)胞集落數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2C、D)。

2.3 Bmi-1基因沉默對(duì)SPC-A1細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

3組SPC-A1細(xì)胞分別接種于裸鼠腋窩皮下后，均可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。所成瘤塊稱重結(jié)果(圖3A、B)顯示，接種SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞的瘤塊重量為(0.69±0.24)g，與接種SPC-A1-ctr (2.11±0.25)g和SPC-A1-wt(2.29±0.29)g細(xì)胞的瘤塊重量相比顯著降低(P＜0.01)，而接種SPC-A1-ctr 和SPC-A1-wt細(xì)胞的瘤塊重量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 Bmi-1基因沉默對(duì)SPC-A1細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果如表1所示，與SPC-A1-ctr［(57.8±1.3)%］和SPCA1-wt［(57.0±1.8)%］兩組細(xì)胞相比，SPCA1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞［(64.6±1.2)%］G0/G1期所占比例明顯升高。SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞S期所占比例減少［(28.61±0.91)%］，與SPC-A1-ctr［(35.69±1.46)%］和SPC-A1-wt［(36.18±0.37)%］兩組細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

圖1 沉默Bmi-1基因?qū)PC-A1細(xì)胞中Bmi-1 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig. 1 Effects of Bmi-1-siRNA on Bmi-1 mRNA and protein expression in SPC-A1 cells

圖2 沉默Bmi-1基因?qū)PC-A1細(xì)胞體外增殖能力的影響Fig. 2 Effects of Bmi-1-siRNA on the proliferation of SPC-A1 cells in vitro

圖3 沉默Bmi-1基因?qū)PC-A1細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響Fig. 3 Effects of Bmi-1-siRNA on the tumorigenesis of SPC-A1 cells in vitro

表1 三組SPC-A1細(xì)胞的細(xì)胞周期比較Tab. 1 Flow cytometric analysis of the cell cycle in SPC-A1 cells (n=3,,%)

表1 三組SPC-A1細(xì)胞的細(xì)胞周期比較Tab. 1 Flow cytometric analysis of the cell cycle in SPC-A1 cells (n=3,,%)

*: Compared with SPC-A1-wt and SPC-A1-ctr groups, P＜0.05.

S Group G0/G1G2/M SPC-A1-wt 56.95±1.85 36.18±0.37 6.74±1.45 SPC-A1-ctr 57.76±1.33 35.69±1.46 6.54±0.71 SPC-A1-Bmi-1-siRNA 64.61±1.25* 28.61±0.91* 6.78±0.35

2.5 Bmi-1基因沉默對(duì)SPC-A1細(xì)胞生長相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測SPC-A1細(xì)胞生長相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默Bmi-1基因后，與SPC-A1-ctr和SPC-A1-wt兩組細(xì)胞相比，SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞中p16INK4a、p53的蛋白表達(dá)并無變化(P＞0.05，圖4、5)，Cyclin D1表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)，PTEN表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)， Akt表達(dá)無改變(P＞0.05，圖4、5)，Ser473 p-Akt表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。使用不同濃度(0～100 nmol/L) PTEN抑制劑bpv(phen)作用于SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞2 h后，采用Western blot檢測Bmi-1、PTEN、Ser473 p-Akt和Akt的蛋白。結(jié)果如圖6所示，隨著抑制劑濃度的升高，PTEN表達(dá)下降，而Bmi-1和Ser473 p-Akt表達(dá)上升。

圖4 沉默Bmi-1基因?qū)PC-A1細(xì)胞中p16、p53和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of silencing Bmi-1 expression on p16INK4a, p53 and Cyclin D1 levels in SPC-A1 cells

圖5 沉默Bmi-1基因?qū)PC-A1細(xì)胞中PTEN、Akt和Ser473 p-Akt蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of Bmi-1-siRNA on Akt activity and PTEN expression

圖6 PTEN抑制劑作用于SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞后，用Western blot檢測Bmi-1和PTEN等蛋白表達(dá)Fig. 6 PTEN inhibitor bpv(phen) rescued p-Akt activity and Bmi-1 expression

3 討 論

Bmi-1基因是荷蘭癌癥中心1991年在鼠淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的［4］。研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞永生化與細(xì)胞衰老中發(fā)揮著重要作用。Bmi-1基因在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)并與腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，如乳腺癌［5］、非小細(xì)胞肺癌［6］、結(jié)直腸癌［7］、胃癌［8］及鼻咽癌［9］等。

在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉默Bmi-1基因的表達(dá)使INK4a位點(diǎn)缺失的A549細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期而影響其體內(nèi)外增殖能力。本次實(shí)驗(yàn)選用了具有INK4a位點(diǎn)的SPC-A1肺腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示：沉默Bmi-1基因的表達(dá)仍能夠抑制SPC-A1細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞的存活率并沒有發(fā)生變化，說明沉默Bmi-1對(duì)SPC-A1細(xì)胞的生長抑制并非是由于細(xì)胞壞死引起的。分析各組細(xì)胞周期結(jié)果得出：Bmi-1-siRNA抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖能力是通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期引起的。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的增殖受細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡水平的調(diào)控［10］。p16INK4a和p53是INK4a/ARF的編碼蛋白及下游分子［11］。在細(xì)胞周期中，p16INK4a的下調(diào)導(dǎo)致對(duì)Cyclin D1與CDK4 (周期素依賴蛋白激酶4)結(jié)合形成復(fù)合體的抑制作用減弱，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖活躍。另外，p53的下調(diào)也能使細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡受到影響。細(xì)胞周期的分布變化受到許多基因的調(diào)控，其中Cyclin D1是目前研究較多的細(xì)胞周期調(diào)控基因之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［12］。CyclinD1是細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子［13］。那么在

SPC-A1細(xì)胞中Bmi-1是否也如文獻(xiàn)中報(bào)道的那樣：沉默Bmi-1能通過其經(jīng)典位點(diǎn)抑制增殖？本次Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默Bmi-1基因后p16INK4a和p53的蛋白表達(dá)并無變化，而Cyclin D1表達(dá)下調(diào)。由上可知，沉默Bmi-1的表達(dá)并沒有上調(diào)p16INK4a，但卻導(dǎo)致了Cyclin D1的下調(diào)，說明Cyclin D1的表達(dá)并沒有依賴p16INK4a調(diào)節(jié)，有可能通過其他方式調(diào)節(jié)使Cyclin D1表達(dá)下降。

有文獻(xiàn)報(bào)道，Bmi-1調(diào)控腫瘤增殖的機(jī)制并非依賴p16INK4a來發(fā)揮作用［14-15］，而是通過調(diào)節(jié)Akt/PKB活性在腫瘤中發(fā)揮作用，并與PI3K/Akt通路有關(guān)［16-18］?？葿mi-1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子，是不能直接作用于PI3K/Akt通路的。Song等［19］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)Bmi-1的表達(dá)能通過抑制PTEN而激活PI3K/pAkt通路，說明PTEN可負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt通路［20-21］。Fan等［22］在對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞的研究過程中發(fā)現(xiàn)，PTEN在細(xì)胞核中與Bmi-1有相互作用，這種相互作用可以使PTEN通過抑制Bmi-1的功能，使端粒酶活性降低；也可以使Bmi-1通過對(duì)PTEN作用，使 Akt活化受到明顯抑制，從而影響腫瘤形成。PI3K/Akt信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞生長的一條重要的信號(hào)通路，Akt是此通路的關(guān)鍵分子之一［23］。我們也在前期研究中發(fā)現(xiàn)，沉默Bmi-1基因的表達(dá)使A549細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期同時(shí)伴有p-Akt和Cyclin D1的表達(dá)的下降，并且可能與PTEN/Akt/Cylin D1通路有關(guān)［3］。那么在SPC-A1細(xì)胞中Bmi-1是否也存在這樣的通路呢？為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，本研究又檢測了PTEN和p-Akt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默Bmi-1后p-Akt的表達(dá)下調(diào)，PTEN表達(dá)上調(diào)；而使用PTEN抑制劑作用于SPC-A1-Bmi-1-siRNA細(xì)胞，卻重塑了Bmi-1和p-Akt的表達(dá)。我們初步推測在肺腺癌SPC-A1中Bmi-1基因可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)了Cyclin D1的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞周期，而且Bmi-1和PTEN之間還存在負(fù)性調(diào)節(jié)。

綜上所述，Bmi-1參與肺腺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖有可能通過這樣的一條信號(hào)通路：Bmi-1→PTEN→PI3K/p-Akt→Cyclin D1，且與PTEN有相互作用。這為研究Bmi-1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖提供了除經(jīng)典通路之外的另一條通路。這條通路在肺腺癌乃至其他腺癌是否具有普遍性，還需進(jìn)一步研究。

致謝 本研究得到大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院趙寶霞老師的幫助和指導(dǎo)，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院聶大平、王朝暉老師的友情幫助，謹(jǐn)在此對(duì)她們表示衷心感謝。

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Effects of Bmi-1-siRNA on proliferation of lung adenocarcinoma SPC-A1 cells and its mechanism

WANG Yi-fang1,2, LIU Ben2, LIU Chun-qing2, ZHENG Xiang-yu2, LIU Dan-dan2, ZHU Jie3, YANG Chun-hui3, MENG Xiu-xiang2(1. Department of Laboratory Diagnosis, Henan Red Cross Blood Center, Zhengzhou Henan 450012, China; 2. College of Laboratory Medicine of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116044, China; 3. Laboratory Center for Diagonostics, Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116044, China; 4. Department of Laboratory Diagnosis, the Second Af fi liated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning116027, China)

Background and purpose:The human oncogene B-cell-speci fi c moloney murine leukemia virus integration site 1 (Bmi-1) is an important member of the polycomb group family, and it regulates cell proliferation and senescence via INK4a/ARF locus. This study investigated the effects of Bmi-1-siRNA on the proliferation of lung adenocarcinoma cell line SPC-A1 cells with INK4a/ARF locus and clarify the mechanism of Bmi-1-mediated effect on proliferation of lung adenocarcinoma cells.Methods:In this study, we chose the most ef fi cient siRNA chain the pGeneshl-2-Bmi-1 sense-1 and inserted into a pSUPER-retro-neo retroviral vector. The packaged si-Bmi-1 pSUPERretro-neo retroviral vector was stably transfected into lung adenocarcinoma SPC-A1 cell line. The stably transfected cells were cultured and passed. After transfection, the levels of Bmi-1 mRNA and protein expression of SPC-A1 cells were analyzed by RT-PCR and Western blot respectively. Trypan blue, MTT and plate colony forming assay were performed to observe the proliferation capibility of SPC-A1 cells and evaluate the cloning forming ability in vitro. The potency of tumorigenesis was observed in nude mouse through hypodermic inoculation of SPC-A1 cells. Cell cycle distribution was analyzed by fl ow cytometry (FCM) in SPC-A1 cells. The expression levels of proliferation proteins including p16INK4a, p53, Cyclin D1, PTEN, Akt and Ser473p-Akt were analyzed by Western blot.Results:The mRNA and protein expression levels of Bmi-1 were signi fi cantly reduced in SPC-A1-Bmi-1-siRNA cells transfected with pSUPER-retroneo retroviral vector. Knockdown of Bmi-1 could inhibit the growth, colony formation in vitro and tumorigenesis in vivo of SPC-A1 cells (P＜0.01). The transfected SPC-A1 cells were arrested in G1phase ［(64.6±1.2)%, P＜0.05］. Compared with two control groups, p16INK4a, p53 and Akt were not affected (P＞0.05), while Cyclin D1 and Ser473p-Akt were downregulated (P＜0.01) and PTEN was up-regulated (P＜0.01) in the SPC-A1-Bmi-1-siRNA cells. SPC-A1-Bmi-1-siRNA cells were treated with various concentrations of PTEN inhibitor to determine expression levels of PTEN, Bmi-1 and Ser473p-Akt protein. Ablation of PTEN rescued Bmi-1 and Ser473p-Akt expression in SPC-A1-Bmi-1-siRNA cells.Conclusion:Knockdown of Bmi-1 gene can arrest the proliferation of SPC-A1 cells through G0/G1phase arrest by inhibiting Cyclin D1 expression indirectly, which may be not associated with p16INK4asignaling pathway.

Bmi-1 gene; Lung adenocarcinoma; Proliferation

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.003

R734.2

A

1007-3639(2014)05-0333-09

2013-12-25

2014-03-11）

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：20072169)。

孟秀香 E-mail:xiuxiang_meng@sina.com