任春霞 徐娜 宋亞琴 趙敏 陳亞萍 呂蓓 楊恭

1.江蘇省無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214023；2.山東省交通醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；3.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；4.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；5.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過Gro-α激活NF-кB核轉(zhuǎn)位和VEGF表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的生長

任春霞1 徐娜1 宋亞琴1 趙敏2 陳亞萍3 呂蓓1 楊恭4,5

1.江蘇省無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214023；2.山東省交通醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；3.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；4.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；5.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)促進(jìn)上皮腫瘤的發(fā)生，其分泌的趨化因子即生長調(diào)節(jié)致癌基因α(growth-regulated oncogene alpha，Gro-α)蛋白在腫瘤間質(zhì)微環(huán)境中促進(jìn)上皮卵巢癌的發(fā)生，但其作用機(jī)制并不清楚。本研究擬測定Gro-α蛋白是否通過激活間質(zhì)成纖維細(xì)胞中NF-кB核轉(zhuǎn)位和VEGF表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的生長。方法：本研究采用ELISA法測定了兩株卵巢癌CAF和兩株正常卵巢組織成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts，NF)條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)中Gro-α的表達(dá)；用CAF-CM或Gro-α分別處理NF，并以NF-кB抑制劑處理作為對照；用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定樣品處理前后NF-кB和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等分子的變化；然后用CAF或NF分別與卵巢癌細(xì)胞系OVCA429混合接種BALB/c裸小鼠，或在有、無NF-кB抑制劑PS1145處理的NF中，用CAFCM或Gro-α處理后，分別與OVCA429混合接種動物，觀察和比較動物移植瘤生長及移植瘤組織中微血管形成情況。結(jié)果：Gro-α在CAF中比在NF中高5～6倍；與對照組相比，用CAF條件培養(yǎng)基或Gro-α處理的NF中NF-кB p65的核轉(zhuǎn)位升高，且VEGF上升，但血管生成抑制因子-血小板反應(yīng)蛋白1下降；用NF-кB抑制劑同時處理NF，可以逆轉(zhuǎn)其VEGF和TSP-1的表達(dá)水平；動物試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAF要比NF更易促進(jìn)腫瘤生長，而CAF-CM或Gro-α處理的NF細(xì)胞可以促進(jìn)動物移植瘤的快速增長和移植瘤組織中微血管的生成，但用NF-кB抑制劑處理的NF則抑制腫瘤生長和血管形成能力。結(jié)論：卵巢癌CAF在腫瘤微環(huán)境中通過自分泌Gro-α，激活NF-кB核轉(zhuǎn)位和VEGF表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌組織血管增生和腫瘤的生長。

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞；生長調(diào)節(jié)致癌基因α；NF-кB核轉(zhuǎn)位；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；卵巢癌

腫瘤間質(zhì)微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用，其中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancerassociated fibroblasts，CAF)對上皮類腫瘤的發(fā)生影響尤為顯著［1］。因此，近年來CAF調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制越來越受到關(guān)注和深入的研究。例如CAF作為腫瘤微環(huán)境中的主要間質(zhì)細(xì)胞，其通過Hedghog信號對前列腺癌具有重要的促進(jìn)作用［2］。另有報道發(fā)現(xiàn)，CAF通過HOXA9調(diào)節(jié)卵巢癌的生長［3］。此外，CAF可能通過AKT1介導(dǎo)的對乳腺上皮細(xì)胞中半胱氨酸蛋白酶抑制劑的表觀遺傳學(xué)沉默來促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生［4］。

血管生成對腫瘤的形成異常重要，是腫瘤細(xì)胞獲得營養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)胞生長、分裂、侵襲和轉(zhuǎn)移的主要動力［5］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調(diào)節(jié)腫瘤血管形成的主要因子之一，VEGF與上皮膜蛋白2一起促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的血管生成和腫瘤生長［6］；此外，VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子Endocan相互作用，促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生［7］。因此，靶向VEGF及其受體的藥物開發(fā)早已是腫瘤治療的首選策略之一［8］。

除了內(nèi)服“宣肺通竅湯”外，我們應(yīng)用傳統(tǒng)的熏鼻外治法，正是祖國醫(yī)學(xué)獨(dú)有的芳香治療法。我們總結(jié)了熏鼻外治法的優(yōu)勢有：①改善嗅覺的傳導(dǎo)性通路：促進(jìn)鼻腔血液循環(huán)，有利炎癥和水腫的吸收，緩解鼻塞且癥狀改善持久，其作用優(yōu)于減充血劑和鼻用激素。②改善嗅覺的化學(xué)性通路：辛夷、藿香、白芷、公丁香、石菖蒲、川芎等藥物都含有植物揮發(fā)油，加熱后具有不同的芳香氣味，可以起到芳香開竅的作用。

生長調(diào)節(jié)致癌基因α(growth-regulated oncogene alpha，Gro-α)蛋白，是由107個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為11.3×103的細(xì)胞因子，其受體主要是與IL-8共用的CXCR2［9］。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子Gro-α蛋白可以使永生化的卵巢上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，而且Gro-α可以誘導(dǎo)卵巢間質(zhì)成纖維細(xì)胞的衰老，進(jìn)而促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在卵巢癌患者的血液和臨床標(biāo)本中均可檢測到上升的Gro-α［10］。有其他研究表明，凝血酶可以通過上調(diào)Gro-α促進(jìn)血管生成［11］。在多發(fā)性骨髓瘤中，Gro-α等分子與腫瘤血管形成和疾病的預(yù)后密切相關(guān)［12］。此外，有報道發(fā)現(xiàn)Gro-α在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要與NF-кB及AKT相關(guān)［13］。然而，Gro-α是否通過激活NF-кB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老和促進(jìn)血管形成，目前鮮見報道。本研究利用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗和體內(nèi)動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Gro-α可能是

通過激活NF-кB和腫瘤血管形成促進(jìn)卵巢癌發(fā)生的。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)基

卵巢癌細(xì)胞系OVCA429由美國M.D. Anderson癌癥中心贈與，具有體外軟瓊脂單獨(dú)生長形成克隆特性和裸鼠體內(nèi)致瘤活性。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640(購自Gibco公司)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱。

CAF和正常卵巢組織成纖維細(xì)胞(normal fibroblasts，NF)來源于無錫市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年9月—2013年6月收治的5例卵巢癌患者。所有患者均為初治患者，術(shù)前均未接受任何治療。CAF取自高級別漿液性卵巢癌組織5例；NF取自乳腺癌患者行去勢的正常卵巢組織3例。標(biāo)本獲取前均與患者簽署知情同意書，獲得患者許可。成纖維細(xì)胞分離的方法詳見文獻(xiàn)［10，14］，基本過程如下：將組織塊用含10%雙抗的PBS溫和的清洗3次，每次5 min，然后用培養(yǎng)基清洗1次，最后把組織置于新的含有15%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10%雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，用無菌手術(shù)刀片切開組織，溫和地刮取切面細(xì)胞，也可用刀背鈍性刮取，之后將細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d之后更換1次培養(yǎng)基，以后每隔3 d更換1次培養(yǎng)基。14 d后，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞密度長到80%～90%時，用胰酶消化并以1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代。如果成纖維細(xì)胞中摻雜有上皮細(xì)胞，可以采用以下方法移除：將培養(yǎng)基吸棄，加入PBS溫和洗滌細(xì)胞2次，加入0.5 mL 0.05%的胰酶(含EDTA)，在室溫下處理并用顯微鏡持續(xù)觀察，大約60 s后，成纖維細(xì)胞脫壁而上皮細(xì)胞仍然貼壁，此時立即用培養(yǎng)基中和，把培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞移至另外一個新的培養(yǎng)皿中，從而將成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開，成纖維細(xì)胞傳代2～3次就可以得到純化的成纖維細(xì)胞。如果不純，可以用胰酶反復(fù)消化處理。目前已經(jīng)成功分離和構(gòu)建到生長良好的5株CAF和3株NF，實(shí)驗中使用CAF和NF分別為體外第3次和第5次傳代細(xì)胞群，無明顯衰老表型，在軟瓊脂中不能獨(dú)立生長形成克隆，而卵巢癌細(xì)胞系OVCA429可以在軟瓊脂中形成克隆。

他跳上望天歸，站在懸崖的邊緣，仰天望，頭頂繁星漫天，低頭看，腳下深淵無底。他心里亂作一團(tuán)，女孩的倩影和微笑，黑袍人誘惑的言語，天葬刀邪笑著的雙瞳，族人們虔誠的跪拜，族長嚴(yán)厲的指責(zé)，師父不安甚至絕望的表情……種種景象在他的眼前浮現(xiàn)，一層層重疊，交叉，粉碎，令他頭痛欲裂。

在國際上，因免費(fèi)開放的、前沿性的課程使網(wǎng)絡(luò)課程引來了廣泛的關(guān)注。如美國之音“教育報道”欄目曾報道過許多關(guān)于網(wǎng)絡(luò)課程的新聞；英國還發(fā)布的《MOOCs和開放教育對高等教育的影響》白皮書；一些頂尖大學(xué)開始建立開放學(xué)習(xí)平臺并將其課程放在網(wǎng)上[4]。美國麻省理工學(xué)院提出了“開放式課程網(wǎng)頁”的概念，并向全世界的學(xué)習(xí)者無償提供世界級的優(yōu)秀課程資源。

1.3 條件培養(yǎng)基或Gro-α處理NF

本研究檢測了CAF19和NF23細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中NF-кB p65亞基的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CAF細(xì)胞核中p65表達(dá)比其細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)高5倍以上(圖2A)。隨后本研究采用含CAF19的CM處理了NF23，分別收集0、12和24 h處理的細(xì)胞，采用Western blot測定了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白組分的p65水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無血清培養(yǎng)基處理的細(xì)胞相比，p65核轉(zhuǎn)位隨處理時間延長而增高(圖2B)。但用Gro-α中和抗體(購自美國R&D System公司)處理的細(xì)胞中，NF-кB的核轉(zhuǎn)位降低(圖2B)。之后，本研究發(fā)現(xiàn)用Gro-α處理的細(xì)胞也有NF-кB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，而加入Gro-α中和抗體則抑制NF-кB的核轉(zhuǎn)位(圖2C)。說明卵巢癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞因其自分泌的Gro-α進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活了NF-кB的核轉(zhuǎn)位；而Gro-α處理的正常間質(zhì)細(xì)胞中，也可以激活NF-кB核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而啟動下游相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3.1 CM的收集

將CAF(第3代)在100 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行正常單層培養(yǎng)至75%的密度，然后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集的培養(yǎng)基即為CAF-CM。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

1.3.2 細(xì)胞處理

2011年，中共中央1號文件《中共中央國務(wù)院關(guān)于加快水利改革發(fā)展的決定》明確提出要確立水功能區(qū)限制納污紅線，從嚴(yán)核定水域納污能力，嚴(yán)格控制入河湖排污總量。為推進(jìn)實(shí)行最嚴(yán)格水資源管理制度，確保實(shí)現(xiàn)水資源開發(fā)利用和節(jié)約保護(hù)的主要目標(biāo)，國務(wù)院辦公廳印發(fā)了《實(shí)行最嚴(yán)格水資源管理制度考核辦法》，對各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）重要江河湖泊水功能區(qū)2015、2020、2030年水質(zhì)達(dá)標(biāo)率控制目標(biāo)均提出了要求。

將NF(第5代)在35 mm培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)至

習(xí)近平總書記這樣寄語當(dāng)代青年大學(xué)生:“現(xiàn)在在高校學(xué)習(xí)的大學(xué)生都是20歲左右,到2020年全面建成小康社會時,很多人還不到30歲;到本世紀(jì)中葉基本實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化時,很多人還不到60歲。也就是說,實(shí)現(xiàn)‘兩個一百年’奮斗目標(biāo),你們和千千萬萬青年將全過程參與?！盵13]可見,當(dāng)今青年一代學(xué)生,是同新時代共同前進(jìn)的一代人,在離開學(xué)校,走上社會之后,將會成為國家改革發(fā)展的生力軍,擔(dān)負(fù)起民族復(fù)興的重要責(zé)任,青年的素質(zhì)能力和精神面貌,將對我國宏偉藍(lán)圖的實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生巨大而深遠(yuǎn)的影響。當(dāng)代中國青年“生逢其時,責(zé)任重大”[14]。青年發(fā)展觀,正是習(xí)近平青年觀的理論核心。

1.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

用細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司，貨號P0027)對上述處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白的分離和提取，最后用BCA法分別測定蛋白濃度。用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)進(jìn)行NF-кB和VEGF、血小板反應(yīng)蛋白1的檢測。細(xì)胞核蛋白以TFⅡB作為加樣對照，細(xì)胞質(zhì)蛋白用β-actin作為對照。

1.3.3 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白的分離

75%的密度，然后用CAF-CM或300 ng/mL的人重組Gro-α(購自美國R&D System公司)、Groα+Gro-α中和抗體(購自美國R&D System公司)或Gro-α+PS1145(NF-кB抑制劑，購自美國Sigma公司，20 μmol/L)處理NF 48 h，收集0、24和48 h處理的細(xì)胞樣品，用PBS或無血清培養(yǎng)基處理48 h的細(xì)胞作為對照。細(xì)胞的蛋白組分用下述方法進(jìn)行提取。

檢測用抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。裂解蛋白用6×的SDS加樣緩沖液(125 mmol/L Tris-HCl pH為6.8、2%SDS、20%甘油、0.2%的溴酚藍(lán))制備成統(tǒng)一適當(dāng)濃度的樣品。樣品分離前，用100 ℃的水浴處理樣品3～5 min。每種樣品取25 μg，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品。之后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF membrane)上，并用10%的脫脂奶粉(Bio-Rad)封閉2 h(室溫或4 ℃)。此后依次加入一抗和HRP(辣根氧化物酶)-偶聯(lián)的二抗(依一抗而定)。期間用含1%吐溫-20的TBS(Tris-HCl，pH為7.5)洗滌3次。蛋白-抗體復(fù)合物用化學(xué)發(fā)光底物(ECL購自Millipore公司)進(jìn)行顯色后，用LAS4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光顯色。

生態(tài)環(huán)境是經(jīng)濟(jì)、社會、文化發(fā)展的基礎(chǔ)，是村民安居樂業(yè)的前提條件。為了實(shí)現(xiàn)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展，鄉(xiāng)村應(yīng)積極推廣環(huán)保教育、加強(qiáng)環(huán)境整治、修復(fù)生態(tài)景觀、倡導(dǎo)生態(tài)建造。

1.5 動物試驗

動物試驗分為2組，第1組分別將CAF19 (第3代)、NF23(第5代)、OVCA429單獨(dú)接種，或?qū)AF19和NF23分別與OVCA429混合接種(1∶50)，觀察動物成瘤率和瘤體增長體積；第2組以NF23與OVCA429細(xì)胞混合接種為基礎(chǔ)，同時設(shè)用CAF-CM或Gro-α處理的NF23細(xì)胞組，以及用CAF-CM或Gro-α處理NF23時加入PS1145以抑制NF23中NF-кB的活性，接種時NF23與卵巢癌細(xì)胞系OVCA429也按1∶50的比例混合。所有動物為6～8周齡BALB/c裸小鼠(購自上海斯萊克公司)。每個細(xì)胞系接種5只裸鼠，接種方法為每只動物皮下兩側(cè)各接種1個點(diǎn)，共10個點(diǎn)；每個點(diǎn)接種的細(xì)胞總數(shù)為500萬。移植瘤體積(V)用ab2×0.52公式計算，其中a為腫瘤長徑，b為短徑，0.52是一個經(jīng)驗常數(shù)［15］。動物實(shí)驗在復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗動物科學(xué)部進(jìn)行，通過了相關(guān)倫理委員會的審查。動物移植瘤組織的病理學(xué)染色和檢測見文獻(xiàn)。

考慮風(fēng)電不確定性的電氣能源系統(tǒng)兩階段分布魯棒協(xié)同調(diào)度//稅月,劉俊勇,高紅均,邱高,胥威汀,茍競//(13):43

試驗對生長傳代較好的2株CAF(第3代)和2株NF(第5代)培養(yǎng)基中的Gro-α進(jìn)行了測定。細(xì)胞培養(yǎng)基的收集見2.3，培養(yǎng)基中Gro-α的測定按試劑盒(購自美國R&D System公司)操作說明。檢測步驟如下：①用PBS稀釋一抗(Gro-α Ab)到0.25 μg/mL，迅速加入100 μL到每個孔中，室溫溫育過夜。②吸出液體，每孔用300 μL緩沖液洗板4次。最后1次洗完后在紙上翻轉(zhuǎn)板，除去殘余的緩沖液。③每孔中加300 μL的封閉液，在室溫下至少溫育1 h。洗板4次，方法同上。④然后將Gro-α標(biāo)準(zhǔn)品(1、0.75、0.5、0.25、0.125及0 ng/mL)進(jìn)行稀釋，加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或者條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)到每個孔中，設(shè)3個復(fù)孔，在室溫中至少溫育2 h。⑤洗板4次，稀釋檢測抗體到1.0 μg/mL，每孔加100 μL。在室溫溫育30 min。⑥洗板4次，以1∶2 000稀釋Avidin-HRP第二抗體，每孔加100 μL，室溫溫育30 min。之后洗板4次，每孔加100 μL顯色劑，室溫下溫育，觀察顏色變化。⑦最后每孔加入終止液50 μL，用(650 nm波長)酶標(biāo)儀讀取A值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Gro-α相對濃度。

2 結(jié) 果

2.1 Gro-α分泌水平

本試驗測定了兩株卵巢癌CAF(CAF19和CAF46)和兩株正常卵巢NF(NF23和NF65) CM中Gro-α的水平，發(fā)現(xiàn)CAF條件培養(yǎng)基中Gro-α＞820 pg/mL，而NF條件培養(yǎng)基中Gro-α濃度＜210 pg/mL；卵巢癌細(xì)胞OVCA429條件培養(yǎng)基中Gro-α的濃度為298±43 pg/mL(圖1)。在后續(xù)的實(shí)驗中我們主要使用CAF19的CM或人重組Gro-α(濃度為300 ng/mL)處理NF23，同時以無血清培養(yǎng)基等作為對照處理細(xì)胞。

2.2 Gro-α激活NF-кB核轉(zhuǎn)位

政府工作報告中指出，在多領(lǐng)域推進(jìn)“互聯(lián)網(wǎng)+”，為數(shù)字中國建設(shè)加油助力。大港油田結(jié)合油氣開發(fā)實(shí)際，提出了在油藏和地面管道場站建設(shè)中應(yīng)用物聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)、云計算、移動應(yīng)用技術(shù)，大力開展“數(shù)字場”建設(shè)。通過平臺化、共享化、集成化，實(shí)現(xiàn)開發(fā)數(shù)據(jù)的自動實(shí)時采集，地質(zhì)模型的自我更新，開發(fā)趨勢的自我判斷和預(yù)警，開發(fā)方案自動比選和智能決策，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)油藏全生命周期的智能化研究與管理，以此提高勞動效率和開發(fā)效益。

2.3 Gro-α通過NF-кB促進(jìn)VEGF表達(dá)，但抑制TSP-1表達(dá)

Gro-α介導(dǎo)的細(xì)胞信號可能主要通過其與受體CXCR2結(jié)合激活NF-кB通路，啟動下游分子的轉(zhuǎn)錄。VEGF是腫瘤血管生成的主要刺激因子，因此我們測定了Gro-α是否通過激活NF-кB促進(jìn)VEGF表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用Gro-α處理的NF23細(xì)胞質(zhì)中VEGF升高，而血管生成抑制因子TSP-1(血小板反應(yīng)蛋白1)的表達(dá)降低，但是用PS1145處理細(xì)胞可見NF-кB核轉(zhuǎn)位下降，細(xì)胞質(zhì)中VEGF下降，而TSP-1升高(圖3)。由此可見，Gro-α誘導(dǎo)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞，可能通過激活NF-кB促使VEGF升高，而抑制TSP-1降低，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤組織的血管形成和腫瘤生長能力。

圖3 Gro-α通過激活NF-кB上調(diào)VEGF下調(diào)TSP-1Fig. 3 Up-regulation of VEGF and down-regulation of TSP-1 through the activation of NF-кB by Gro-α

2.4 Gro-α處理的NF通過促進(jìn)血管生成，加速卵巢癌細(xì)胞的腫瘤生長能力

為了檢測Gro-α誘導(dǎo)的NF-кB活化和VEGF的表達(dá)是否促進(jìn)上皮卵巢癌細(xì)胞的腫瘤形成和生長能力，本研究單獨(dú)接種CAF19、NF23或OVCA429，或?qū)AF19或NF23分別以1∶50的比例與卵巢癌細(xì)胞系OVCA429混合接種裸鼠(圖4A)；或用不同組合處理的NF23與卵巢癌細(xì)胞系OVCA429混合接種裸鼠(圖4B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAF19和NF23單獨(dú)接種的動物不成瘤，而OVCA429作為卵巢癌細(xì)胞系可以單獨(dú)成瘤；將CAF19或NF23與OVCA429混合后接種，發(fā)現(xiàn)CAF比NF能顯著促進(jìn)腫瘤的生長(圖4A)；用CAF-CM或Gro-α處理的NF23比未處理或同時用NF-кB抑制劑PS1145處理的細(xì)胞更能增進(jìn)腫瘤的生長(圖4B)；試驗代表性移植瘤的腫瘤組織及荷瘤動物圖見圖4C和4D。最后，我們對移植瘤組織分別進(jìn)行組織學(xué)HE染色和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異抗原CD34的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Gro-α水平的升高會促進(jìn)腫瘤組織中微血管的增加(圖4E、F)。

圖4 動物移植瘤生長曲線以及移植瘤組織中微血管密度檢測Fig.4 Growth curves of animal xenograft tumors and detection of micro-blood vessel density in xenograft tumor tissues

這些結(jié)果均表明，卵巢癌CAF中Gro-α可能以激活間質(zhì)成纖維細(xì)胞NF-кB的核轉(zhuǎn)位的方式，促進(jìn)VEGF過量分泌，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，加速腫瘤的生長。

3 討 論

本試驗利用人體卵巢癌和正常卵巢組織標(biāo)本中分離的CAF和NF進(jìn)行對比性研究，發(fā)現(xiàn)其自分泌的Gro-α主要通過激活NF-кB核轉(zhuǎn)位，提高細(xì)胞分泌VEGF和降低TSP-1表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌血管生成和腫瘤的生長。

話剛落音，雨心不辭而別。茶館頓時冷場了，蔣浩德悔不該打這個主意。年輕時，他就吃過雨心的閉門羹，老來還是這樣。真想活個樣子出來，找一個比她強(qiáng)百倍的人。紫云看在眼里，先穩(wěn)住神，輕聲說道：“伯伯也不必太悲傷，師母正在失夫之痛中，到時候……”

近年來研究發(fā)現(xiàn)，CAF可能在腫瘤微環(huán)境中對上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用［16-17］。有研究發(fā)現(xiàn)，CAF中IL-8可能通過激活NF-кB，誘導(dǎo)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移［18］。NF-кB作為炎性反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌中對IL-8和VEGF表達(dá)具有重要的啟動作用［19］。此外，在胰腺癌中，NF-кB的活化也與IL-8和VEGF的升高密切相關(guān)［20］。另外，以前也有研究發(fā)現(xiàn)，Gro-α可能通過激活NF-кB進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。本研究結(jié)果表明，CAF通過自分泌Gro-α激活NF中NF-кB，使其分泌大量的VEGF，促進(jìn)血管生成，對卵巢癌細(xì)胞的快速增生十分重要。

與NF相比，癌相關(guān)CAF具有體外傳代次數(shù)少和快速衰老的特征，因此CAF衰老可能是組織微環(huán)境中細(xì)胞從炎性反應(yīng)向惡性轉(zhuǎn)化的特征。我們曾報道Gro-α可以促進(jìn)NF衰老，衰老的NF產(chǎn)生更多細(xì)胞因子包括Gro-α，在動物體內(nèi)可以誘導(dǎo)永生化上皮細(xì)胞形成腫瘤［10］。本研究揭示腫瘤血管生成的主要作用機(jī)制之一：即間質(zhì)成纖維細(xì)胞由于NF-кB的激活而產(chǎn)生VEGF，其原動力之一可能是來自CAF分泌的Gro-α。本研究結(jié)果對于深入闡明腫瘤微環(huán)境中血管形成的機(jī)制和尋找以血管形成為靶點(diǎn)的藥物或診斷分子可能具有一定的理論和臨床意義。

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Promotion of ovarian tumorigenesis by cancer-associated fi broblasts through Gro-α activated NF-кB nuclear translocation and high expression of VEGF

REN Chun-xia1, XU Na1, SONG Ya-qin1, ZHAO Min2, CHEN Ya-ping3, LV Bei1, YANG Gong4,5(1.Department of Gynecology and Obstetrics, The People’s Hospital of Wuxi, Wuxi Jiangsu 214023, China; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, Shandong Jiao Tong Hospital, Jinan Shandong 250031, China; 3.Department of Gynecology and Obstetrics, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University Shanghai 200240, China; 4.Central Laboratory, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University Shanghai 200240, China; 5.Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: LV Bei E-mail: lvbei@wuxiph.com

Background and purpose:Ovarian cancer-associated fi broblasts (CAF) are known to promote epithelial malignancy. The chemoattractant cytokine growth-regulated oncogene alpha (Gro-α) secreted from CAF has been reported to mediate the stroma-epithelia interaction in tumor microenvironment, leading to the development of epithelial ovarian cancer, however, the detailed mechanism is unknown.This study was to determine whether Gro-α could promote ovarian tumorigenesis through activating NF-кB nuclear translocation and VEGF expression in stromal fi broblasts.Methods:ELISA was used to measure the levels of Gro-α in two cancer-associated fi broblasts (CAF) and normal fi broblasts (NF) isolated from high-grade serous ovarian cancer or normal ovarian tissues. CAF conditioned medium (CM) or Gro-α was used to treat NF, while PS1145, the inhibitor of NF-кB, was used as control. NF-кB subunit p65 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by Western blot in cells after treatment. Xenograft tumors from nude mice were generated by injection of CAF, NF, or OVCA429 alone or OVCA429 mixed with CAF or NF, and by injection of OVCA429 mixed with NF cells that were treated with or without CAF-CM or Gro-α, or with NF cells that were treated with CAF-CM or Gro-α plus PS1145. The tumor growth curve was measured and the blood vessel density in xenograft tumor tissues was examined by histopathological analysis.Results:The levels of Gro-α were 5-6 folds higher in CAF than in NF. Treatment of NF with CAF-CM or Gro-α stimulated the nuclear translocation of NF-кB subunit p65, and the expression of VEGF, but suppressed the expression of thrombospondin 1, the antiangiogenesis factor, compared with control cells. However, treatment of NF with the NF-кB inhibitor PS1145 reversed these results. The animal assay revealed that CAF stimulated tumor growth stronger than NF, and NF treated with CAF-CM or Gro-α, but not along with PS1145, enhanced xenograft tumor growth through promoting angiogenesis.Conclusion:Ovarian CAF promotes the nuclear translocation of NF-кB and the expression of VEGF through Gro-α autocrine in tumor microenvironment to facilitate angiogenesis and ovarian cancer development.

Cancer-associated fi broblasts; Gro-α; NF-кB nuclear translocation; Vascular endothelial growth factor; Ovarian cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.001

R737.31

A

1007-3639(2014)05-0321-08

2013-12-20

2014-04-11）

南京醫(yī)科大學(xué)面上基金(No：2012NJMU179)；國家自然科學(xué)基金面上項目(No：NSFC91129721)。

呂蓓 E-mail:lvbei@wuxiph.com