陳 鈞，王建新

（復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，藥劑學(xué)教研室，上海 201203）

藥劑學(xué)專業(yè)本科生藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

陳 鈞，王建新

（復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，藥劑學(xué)教研室，上海 201203）

設(shè)計(jì)了本科生藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討了該實(shí)驗(yàn)的可行性，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，證明該實(shí)驗(yàn)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便，測(cè)定方法具有較好的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、回收率和精密度。與原先設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)，測(cè)定藥動(dòng)學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確，可以替代原先藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從而提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

高效液相色譜法；頭孢丙烯；學(xué)生實(shí)驗(yàn)

藥物動(dòng)力學(xué)是定量研究藥物及制劑在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的一門科學(xué)，對(duì)于新藥研發(fā)、藥物新劑型和新制劑設(shè)計(jì)、藥物療效和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)以及臨床合理應(yīng)用均具有重要指導(dǎo)意義。藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)是藥動(dòng)學(xué)理論與實(shí)踐密切相結(jié)合的重要組成部分，能使學(xué)生鞏固課堂教授的理論知識(shí)，提高動(dòng)手能力，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)莫?dú)立思考和解決問(wèn)題的能力，對(duì)于提高學(xué)生的藥學(xué)專業(yè)素質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。原來(lái)本實(shí)驗(yàn)課程選用的實(shí)驗(yàn)是“血藥濃度法測(cè)定家兔口服阿司匹林混懸劑和片劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)”，該實(shí)驗(yàn)存在以下問(wèn)題：

1.所測(cè)定的阿司匹林的代謝物水楊酸的半衰期為5～8小時(shí)，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)取樣設(shè)計(jì)的指導(dǎo)原則，取樣持續(xù)時(shí)間應(yīng)該至少為3～5個(gè)半衰期，即最終取樣持續(xù)時(shí)間應(yīng)該至少為給藥后24小時(shí)，這對(duì)于學(xué)生實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是非常不方便的。

2.樣品處理和測(cè)定的方法為將血漿中水楊酸衍生化后再用有機(jī)溶劑提取，隨后采用熒光分光光度檢測(cè)方法。該樣品處理方法較為繁瑣，在處理過(guò)程中樣品容易發(fā)生乳化而導(dǎo)致樣品損失；另外由于采用測(cè)定的方法為熒光分光光度法，此方法并不具備色譜分離的功能，導(dǎo)致測(cè)定方法的專屬性不高，準(zhǔn)確度差，測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算時(shí)存在很大誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠?；诖?，我們對(duì)本科生的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革，將實(shí)驗(yàn)改為“血藥濃度法測(cè)定家兔口服頭孢丙烯膠囊劑和片劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)”，采用頭孢丙烯為實(shí)驗(yàn)藥物，并且建立了操作簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑沉淀法處理家兔血漿樣品并采用高效液相（HPLC）-紫外檢測(cè)器測(cè)定血漿中頭孢丙烯的測(cè)定方法。我們將該方法應(yīng)用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)，使實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間大大縮短，預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，更重要的是所測(cè)得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)更加準(zhǔn)確，取得較好的教學(xué)效果。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.實(shí)驗(yàn)藥物。實(shí)驗(yàn)制劑1：頭孢丙烯膠囊；規(guī)格：每粒含頭孢丙烯250mg；生產(chǎn)廠家：上海普康藥業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)制劑2：頭孢丙烯片；規(guī)格：每片含頭孢丙烯250mg；生產(chǎn)廠家：中美上海施貴寶制藥有限公司

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔（性別：雌雄不限，體重2-3Kg左右，同一批家兔體重差異最好不超過(guò)0.2kg—0.3kg）

3.實(shí)驗(yàn)方法。①給藥方案。a.家兔采血方法及血樣保存：家兔實(shí)驗(yàn)前禁食一天，采血前將其放入兔箱中，待安靜后，剪去耳緣側(cè)兔毛，暴露家兔耳緣靜脈，用酒精棉球擦拭兔耳緣使血管充盈，選取兔近耳尖耳緣靜脈血流交匯處切一小口，干棉球擦拭，滴取空白血約0.5～1.0ml于預(yù)加肝素試管中，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層約0.2～0.4ml血漿于離心管中，-18℃冰箱保存。b.家兔口服片劑或者膠囊（2片或2粒）：一同學(xué)將坩堝鉗橫插于家兔口內(nèi)，翻轉(zhuǎn)，將舌頭壓在坩堝鉗下，另一同學(xué)用鑷子夾住片劑，從坩堝鉗的孔中水平送入至咽部，用鑷子將片子塞入，片子落入食管，然后用注射針筒灌胃，緩慢給予家兔溫水20ml。c.定時(shí)采血：兩種制劑給藥后，分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6小時(shí)取血約0.5～1.0ml于預(yù)加肝素試管中，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層約0.3～0.5ml血漿于離心管中，-18℃冰箱保存。②血樣測(cè)定。a.色譜儀器。日本島津公司高效液相色譜儀，包括LC-10AT VP泵，SPD-10A VP型紫外檢測(cè)器，CTO-10A柱溫箱及杭州英譜公司HS2000色譜工作站b.色譜條件。色譜柱：采用DIKMAC18色譜柱（200×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸（用三乙胺調(diào)至pH2.3）：甲醇＝75：25；流速：1.2ml/min；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nmc.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取頭孢丙烯標(biāo)準(zhǔn)品一定量，用水配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精移取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水稀釋至含頭孢丙烯1，5，10，50，100，200，500μg/ml，分別精密取上述溶液10μl，加入90μl空白兔血漿，然后加入300 μl甲醇（用于沉淀蛋白），渦旋混合10秒，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液100 μl，然后加蒸餾水100 μl，渦旋混合10秒，微量進(jìn)樣器進(jìn)樣20 μl，采用高效液相-紫外檢測(cè)，記錄峰面積（A），建立A對(duì)C（濃度）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。d.血漿樣品的處理與測(cè)定。空白血漿或樣品血漿室溫下解凍，待融化后，精密移取100 μl，加入300 μl甲醇，渦旋混合10秒，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液100 μl，然后加蒸餾水100 μl，渦旋混合10秒，微量進(jìn)樣器進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積（A）。將測(cè)得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，采用外標(biāo)法計(jì)算血漿樣品中頭孢丙烯濃度。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.專屬性考察：在此色譜條件下，頭孢丙烯與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)均完全分離，峰形尖銳，其保留時(shí)間約為9.5分鐘，其他均為內(nèi)源性雜質(zhì)。考察了6份不同來(lái)源的家兔血漿，在所建立的HPLC條件下，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾頭孢丙烯的測(cè)定，其典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC分析典型圖譜

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性：以藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對(duì)藥物濃度（C，μg/ml），用線性回歸方法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線（加權(quán)系數(shù)為1/C），結(jié)果如下：Y=9876C-243（r=0.9999，n=6），線性范圍：0.1～50μg/ml。

3.提取回收率。取空白兔血漿0.5 ml數(shù)份，分別加入頭孢丙烯標(biāo)準(zhǔn)溶液使血漿中頭孢丙烯的濃度分別為0.1，5，50μg/ml，按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，記錄峰面積（A1）。另取0.1，5，50μg/ml頭孢丙烯標(biāo)準(zhǔn)液，按照血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，記錄峰面積（A2），由兩者的比值計(jì)算提取回收率，經(jīng)測(cè)定高中低個(gè)濃度的提取回收率在93.07%～99.14%之間，符合提取回收率的要求。

4.方法回收率。取空白兔血漿0.5ml數(shù)份，分別加入頭孢丙烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血漿中頭孢丙烯的濃度分別為0.1，5，50μg/ml，每一濃度配制5份樣品，按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析。將測(cè)得的濃度與樣品配制的濃度相比，得方法回收率。經(jīng)測(cè)定，高中低濃度的測(cè)定值在96.95%～99.92%之間，符合方法回收率的測(cè)定要求。

5.批內(nèi)、批間精密度。配制0.1，5，50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血樣各5管，于同一天以一個(gè)批次按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，計(jì)算測(cè)定數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，即為批內(nèi)精密度。以后連續(xù)測(cè)定5天，每天以一個(gè)批次測(cè)定上述濃度的樣品，計(jì)算批間精密度。結(jié)果批內(nèi)精密度和批間精密度均小于3.13%，符合精密度的測(cè)定要求。

三、討論

1.實(shí)驗(yàn)藥物的選擇。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，頭孢丙烯在體內(nèi)的半衰期為1～2小時(shí)，達(dá)峰時(shí)間約為1.5小時(shí)。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，取樣時(shí)間應(yīng)為3～5個(gè)半衰期，因此本實(shí)驗(yàn)的取樣時(shí)間為6小時(shí)即可，比原先實(shí)驗(yàn)需要24小時(shí)的取血時(shí)間大為縮短，實(shí)際操作性好。

2.樣品預(yù)處理方法的選擇。本實(shí)驗(yàn)的樣品預(yù)處理方法為沉淀蛋白法，操作極為簡(jiǎn)單，引入誤差小，樣品的取用量少。而原先樣品預(yù)處理方法為衍生化后有機(jī)溶劑提取法，該方法操作繁瑣，在處理過(guò)程中樣品容易發(fā)生乳化而導(dǎo)致樣品損失；另外該方法的血漿樣品取用量大，實(shí)際操作性差。

3.測(cè)定方法的選擇。本實(shí)驗(yàn)中我們開(kāi)發(fā)了測(cè)定家兔血漿中頭孢丙烯的高效液相色譜測(cè)定方法，該方法靈敏、專屬、準(zhǔn)確性高，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定準(zhǔn)確。原先實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的測(cè)定的方法為熒光分光光度法，此方法并不具備色譜分離的功能，導(dǎo)致測(cè)定方法的專屬性不高，準(zhǔn)確度差，測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算時(shí)存在很大誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。

經(jīng)本校2011、2012級(jí)本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)證明，該實(shí)驗(yàn)方法操作性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)化、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，達(dá)到了較好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的。

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G642.0

A

1674-9324（2014）42-0279-03

陳鈞，男，副教授，博士生導(dǎo)師，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，藥劑學(xué)教研室。

王建新，男，教授，博士生導(dǎo)師，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，藥劑學(xué)教研室。