劉 繼，顏 靜，何靖柳，董紅敏，郭 菲，熊亞波，黃 影，秦 文,*

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

生姜貯藏期病原菌分離鑒定及精油抑菌效果

劉 繼1,2，顏 靜2，何靖柳2，董紅敏2，郭 菲2，熊亞波2，黃 影2，秦 文2,*

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

分離、純化及鑒定生姜貯藏期病原菌，篩選出對(duì)抑制病原菌效果較好的精油并驗(yàn)證該精油抑菌效果。通過(guò)分離、純化及致病性實(shí)驗(yàn)得到了病原菌菌株ljr4及l(fā)jw2。以病原菌18S rDNA序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明該兩種病原菌分別屬于鐮刀菌屬及被孢霉屬。根據(jù)病原菌種屬選擇了6 種精油進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉桂精油及百里香精油在用量為2 000 μL/L時(shí)對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率均為100%。在藥敏實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肉桂精油比百里香精油抑菌活性更強(qiáng)。肉桂精油對(duì)ljr4、ljw2這2 種病原菌最低抑菌用量分別為64、32 μL/L，最低殺菌用量分別為125、500 μL/L。與未熏蒸生姜相比，在貯藏30 d后肉桂精油熏蒸處理分別使接種ljr 4及l(fā)jw2的生姜感病率下降了59.33%和47.33%。肉桂精油作為生姜貯藏前的熏蒸劑有較好的應(yīng)用前景。

鐮刀菌；被孢霉；18S rDNA；肉桂精油；抑菌效果

生姜（Zingiber officinale Roscoe）含有多種烯萜類及酚類物質(zhì)，獨(dú)特的風(fēng)味使其成為亞洲地區(qū)的傳統(tǒng)調(diào)味品，并逐漸被全世界的消費(fèi)者所接受。目前已知生姜具有降血脂、強(qiáng)心、抗氧化、抗腫瘤、防腐殺蟲和護(hù)膚美容等多方面的用途[1]。由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，我國(guó)的生姜種植面積已自2008年的150萬(wàn)畝攀升至2012年的450萬(wàn)畝。姜的食用部分為根狀莖，其表面附著的源自土壤 的各種微生物可能導(dǎo)致貯藏期生姜感病，且傳統(tǒng)的窖藏、埋藏、井藏等方 法受天氣及土壤的影響較大，溫、濕度不易調(diào)控，為微生物大量生長(zhǎng)及繁殖創(chuàng)造了條件。目前關(guān)于生姜貯藏期病害及天然殺菌劑的研究較少，缺乏對(duì)于針對(duì)性用藥的指導(dǎo)，這 也是“硫磺熏姜”類事件發(fā)生的根本 原因。由于生姜?dú)馕稘庥?，病害初期很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)，如不能有效預(yù)防及控制病害不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至可能會(huì)導(dǎo) 致食品安全問(wèn)題。

在目前關(guān)于生姜貯藏期病害的研究中，只有Stirling[2]明確提出尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）會(huì)造成種姜貯藏過(guò)程中的腐敗，關(guān)于生姜貯藏過(guò)程的病原菌分離鑒定工作目前進(jìn)行的較少。由于生姜表皮幼嫩并且在采收過(guò)程會(huì)引起無(wú)法避免的傷口，所以使用的抑菌劑必須是

無(wú)毒低殘留甚至是無(wú)殘留的。精油是植物特有的次生代謝產(chǎn)物，主要由萜類、芳 香族類、脂肪族類等化合物的混合物組成，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，是一種重要的天然防腐劑，并且由于其高揮發(fā)和低殘留特性，在果蔬保鮮事業(yè)中擁有廣闊的應(yīng)用前景。

肉桂（Cinnamomum zeylanicum）[3]、百里香（Thymus v ulgaris）[4]、丁香（Syzygium aromaticum）[5]、茶樹(shù)（Melaleuca alternifolia）精油[6]、山蒼子（Litsea cubeba）[7]、羅勒（Ocimum basilicum）[8]都對(duì)鐮刀菌屬（Fusarium sp.）微生物有明顯的抑制作用。此外這些植物精油也對(duì)其他屬的多種微生物有顯著的抑菌作用，如肉桂精油對(duì)匍枝根霉（R. stolonifer）、黑曲霉（A. niger）、臘葉枝孢（C. herbarum）、灰霉菌（B. cinerea）、炭疽菌（C. coccodes）有良好的抑制作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)從感病生姜表皮分離到的微生物進(jìn)行純化，將純化后的微生物接種于健康生姜進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)。對(duì)確定為病原菌菌株的18S rDNA保守序列測(cè)序，通過(guò)該保守序列的進(jìn)化樹(shù)分析確定病原菌種屬。以病原菌種屬為依據(jù)，選用百里香、肉桂、丁香、羅勒、茶樹(shù)葉精油作為殺菌劑進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)、藥敏性實(shí)驗(yàn)及活體抑菌實(shí)驗(yàn)。本研究旨在為生姜貯藏期殺菌劑選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萊蕪大姜分別購(gòu)自四川國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品交易中心及高水蔬菜批發(fā)市場(chǎng)，病原菌分離材料為貯藏期感病生姜，致病性實(shí)驗(yàn)及活體抑菌實(shí)驗(yàn)材料為健康生姜。

供試精油分別提取自百里香（Thymus vulgaris）葉、丁香（Syzygium aromaticum）葉、肉桂（Cinnamomum zeylanicum）皮、山蒼子（Litsea cubeba）果實(shí)、茶樹(shù)（Melaleuca alternifolia）葉、羅勒（Ocimum basilicum）葉江西吉安盛大香料油公司；不透氣封口膜 美國(guó)Omega公司；UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒、UNIQ柱式DNA膠回收試劑盒 上海生工生物工程有限公司。

沙堡弱培養(yǎng)基（sabourand’s agar，SDA）配方（每1 000 mL）：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、瓊脂12 g，pH （6.5±0.2）。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrition agar，NA）配方（每1 000 mL）：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g，pH（7.2±0.2）。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 中國(guó)雷磁分析儀器廠；BR4i型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Electron公司；3730測(cè)序列分析儀 美國(guó)Applied Bio Systems公司；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海琪特分析儀器有限公司；Gene Genius Bio Image凝膠成像系統(tǒng)英國(guó)Syngene公司；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、移液器（范圍100～1 000、20～200、0.5～10 μL） 加拿大Bio Basic公司；U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離

選擇被微生物侵染、帶有明顯腐爛痕跡的生姜莖塊，使用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液進(jìn)行表面消毒后，以清水沖洗，將患病組織切割成面積為5 mm×5 mm×3 mm（長(zhǎng)×寬×厚度）的小塊，放置于研缽，加入1 mL無(wú)菌蒸餾水搗碎后分別劃線接種于SDA培養(yǎng)基及NA培養(yǎng)基，繼續(xù)以SDA和NA培養(yǎng)基純化各菌株，至連續(xù)3 次純化過(guò)程無(wú)其他菌落出現(xiàn)。

1.3.2 致病性測(cè)試

參照Vero等[9]的方法將純化后的微生物接種于生姜上，微生物接種量為2×105CFU/mL。將接種不同微生物的莖塊分別裝入不同的PE袋中并密封，共3 個(gè)重復(fù)組，每組16 塊莖塊分別裝于4 個(gè)PE袋，所接種生姜于28 ℃，相對(duì)濕度90%條件下存放10 d。以上述方法分離發(fā)病部位微生物，并與該組接種的微生物對(duì)比，如果形態(tài)學(xué)鑒定一致則確定為病原菌。

1.3.3 病原菌18S rDNA序列分析

測(cè)定已確定病原菌的18S rDNA序列，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析確定病原菌種屬，并以此為精油種類的選擇提供依據(jù)。測(cè)序所用菌絲于28 ℃條件下預(yù)先培養(yǎng)5 d，DNA的提取參照Bargues等[10]的方法，18S rDNA序列PCR擴(kuò)增引物如下：

NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）

NS6（5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’）

PCR反應(yīng)參照Z(yǔ)hao等[11]的方法，18S rDNA片段測(cè)序由ABI PRISM 3730 DNA測(cè)序儀完成。所獲得序列提交GenBank并使用BLAST（basic local alignment search tool）在GenBank進(jìn)行比對(duì)。收集相關(guān)菌種的18S rDNA序列，以MEGA5.2構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，大致確定病原所屬種屬，為有針對(duì)性的選擇抑菌劑提供依據(jù)。

1.3.4 精油抑菌效果實(shí)驗(yàn)

根據(jù)病原菌鑒定結(jié)果，確定了以百里香、丁香、肉桂、山蒼子、羅勒、茶樹(shù)等植物中提取的精油作為供試抑菌劑，所選取供試精油已被報(bào)道對(duì)分離鑒定的病原菌同屬微生物中一種或幾種有抑制作用。精油抗菌活性實(shí)

驗(yàn)方法參照Singh等[12]報(bào)道的污染食物技術(shù)，所有精油用量均為2 000 μL/L，全部處理均重復(fù)3 次。接種3 d后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，以在未加入精油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的同種菌正常菌落為對(duì)照，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式如下：

式中：dc為對(duì)照組菌落直徑平均值/mm ；dt為處理組菌落直徑平均值/mm。

1.3.5 藥敏性實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步測(cè)試對(duì)病原菌抑菌效果較好的幾種精油的最低抑菌用量，將各種病原菌菌懸液50 μL（2×105CFU/mL）加入平板中，于30 ℃條件下培養(yǎng)6 h。待水分蒸發(fā)后將140～1 μL（熏蒸用量2 000～16 μL/L）的精油均勻涂抹至培養(yǎng)皿。關(guān)閉培養(yǎng)皿并以不透氣膜封口，標(biāo)記為X-2 000至X-16。其中X為精油簡(jiǎn)寫，每個(gè)用量設(shè)置為上一用量1/2，于30 ℃條件下培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況。以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低用量作為該精油對(duì)該種病原菌的最低抑菌用量（minimal inhibitory concentration，MIC）。

確定MIC以后，取出大于MIC處理的所有平板，以1 mL滅菌水沖洗其培養(yǎng)基表面，將洗液轉(zhuǎn)移至無(wú)精油的培養(yǎng)皿中，標(biāo)記為R-2 000至R-A。R表示該測(cè)試主要以病原菌能否恢復(fù)生長(zhǎng)來(lái)衡量病原菌是否死亡，A為該精油對(duì)該菌MIC。從以上R-2 000至R-A每組取任意一只培養(yǎng)皿，再次加入50 μL（2×106CFU/mL）對(duì)應(yīng)菌懸液作為對(duì)照組，于30 ℃條件下培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，以對(duì)照組正常生長(zhǎng)，處理組菌落數(shù)小于5的處理用量為最低殺菌用量（minimal fungicidal concentration，MFC）。

1.3.6 活體抑菌實(shí)驗(yàn)

以藥敏實(shí)驗(yàn)中對(duì)病原菌MIC及MFC較小的精油進(jìn)行活體抑菌實(shí)驗(yàn)。熏蒸處理前2 d，將每種病原菌分別接種于健康的生姜，參照Vero等[9]的方法，接種微生物數(shù)量為2×105CFU/mL。在溫度25 ℃、相對(duì)濕度90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。熏蒸處理用量為所使用精油的最低殺菌用量，熏蒸在12 ℃、相對(duì)濕度90%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行，精油使用放置于培養(yǎng)箱中的電熱板進(jìn)行加熱，處理時(shí)間為3 d。熏蒸完成后，將生姜放置于避光的空氣流通處使殘余精油揮發(fā)，分別以接種不同病原菌后未進(jìn)行熏蒸處理的生姜為對(duì)照。接種ljr4的莖塊以切開(kāi)接種部位后能夠觀察到接種組織附近有紅色病斑為衡量發(fā)病的標(biāo)準(zhǔn)；接種ljw2的莖塊以接種部位及周圍能夠觀察到白色菌絲為衡量發(fā)病的標(biāo)準(zhǔn)，于處理完成后10、20、30 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

本實(shí)驗(yàn)從貯藏期腐敗、霉變的生姜中分離出了4 種真菌及3 種細(xì)菌。在病原菌測(cè)試中，從生姜的發(fā)病部位分離得到的微生物中有2 種與原接種微生物一致。在接種的其他處理中也分離得到該2 種微生物分別標(biāo)記為ljr4及l(fā)jw2，30 ℃培養(yǎng)4 d后其菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 生姜貯藏期病原菌分離、菌落形態(tài)及發(fā)病癥狀Fig.1 Pathogen isolation, colony morphology, and pathogenicity test

ljr4菌落近圓形，單菌落能擴(kuò)展至直徑9 cm，邊緣不規(guī)則，菌落正面白色至4 d后為粉紅色，菌落反面培養(yǎng)初為淡黃色4 d后為粉紅色，菌絲為樹(shù)枝狀無(wú)隔長(zhǎng)菌絲，被感染生姜初期莖塊外層組織能觀察到粉紅色斑點(diǎn)，較不明顯，后期表皮呈深紅色至褐色可觀察到少量菌絲，菌絲長(zhǎng)而稀疏。

ljw2菌落近圓形，蓮花狀，單菌落能擴(kuò)展至直徑7 cm，邊緣缺刻，菌落正面為白色，背面為淡黃色，菌絲為鹿角狀有隔菌絲，被感染生姜莖塊上明顯可見(jiàn)白色菌絲，菌絲短而致密。

18S rDNA序列分析結(jié)果表明，2 種病原菌與鐮刀菌屬及被孢霉屬微生物保守序列相似度最高。該2 種病原菌的18S rDNA序列NCBI登錄號(hào)分別為：KC833484.1及KC833483.1。

圖2 Mortierella sp. ljw2、Fusarium sp. ljr4和相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Mortierella sp. ljw2, Fusarium sp. ljr4, and their relative strains

進(jìn)化樹(shù)分析（圖2）顯示，該兩種病原菌分別與Fusarium culmorum及Mortierella parvispora具有最高的同源性。ljr4菌株與黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）親緣關(guān)系較近，與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）及腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ljw2菌株與被孢霉屬親緣關(guān)系較近，與毛霉菌（Mucoromycotina sp.）及內(nèi)囊霉（Endogone sp.）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 不同精油抑菌效果對(duì)比

本實(shí)驗(yàn)選擇已經(jīng)報(bào)道的對(duì)鐮刀菌屬微生物有較好抑制效果的精油進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)。

表1 精油對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率Table 1 Inhibition rates of toxic media on mycelial growth of pathogenic fuunnggii %

如表1所示，百里香和肉桂精油在2 000 μL/L用量下對(duì)兩種病原菌生長(zhǎng)的抑制率為100%，該用量下丁香和羅勒精油對(duì)ljr4抑制率為100%，但對(duì)于ljw2的抑制率分別為54.89%和60.03%，抑菌效果不明顯。山蒼子及茶樹(shù)精油在該用量下對(duì)兩種病原菌都有一定的抑制作用，但不能達(dá)到抑制率100%的效果，且對(duì)ljw2的抑制效果顯著低于其他精油。

2.3 藥敏性實(shí)驗(yàn)

表2 肉桂精油及百里香精油對(duì)病原菌的MIC及MFCTable 2 Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicidal concentration (MFC) of thyme and cinnamon essential oil on pathogenic fungi

如表2所示，百里香對(duì)鐮刀菌及被孢霉的MIC分別為64和250 μL/L，其對(duì)ljw2的熏蒸處理MFC為2 000 μL/L。與百里香精油相比，兩種病原菌都對(duì)肉桂精油熏蒸處理更為敏感，肉桂精油對(duì)ljr4和ljw2的熏蒸MIC分別為64 μL/L和32 μL/L，熏蒸MFC分別為125 μL/L和500 μL/L。

肉桂及百里香精油對(duì)ljr4的MIC均為64 μL/L，但肉桂精油對(duì)ljw2的MIC僅為百里香的約1/8。肉桂及百里香精油對(duì)ljr4的MFC分別為125、250 μL/L，肉桂精油對(duì)ljw2的MFC為500 μL/L，為百里香精油的1/4。由此可見(jiàn)，肉桂精油熏蒸處理對(duì)ljr4和ljw2效果優(yōu)于百里香精油。

2.4 活體抑菌實(shí)驗(yàn)

離體條件下肉桂精油熏蒸處理對(duì)ljr4及l(fā)jw2菌株的最低殺菌用量分別為125 μL/L和500 μL/L。如圖3所示，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，經(jīng)過(guò)熏蒸處理的A組和C組感病率都小于未處理的B組和D組（P≤0.05，n=3）。在活體實(shí)驗(yàn)中接種ljr4的對(duì)照組B在貯藏30 d后感病率為70%，該感病率約為熏蒸處理組A的6.36 倍。接種ljw2的對(duì)照組D在貯藏30 d后感病率為58%，該感病率為熏蒸處理組C的7.25 倍。貯藏30 d后肉桂精油熏蒸處理分別使接種ljr4及l(fā)jw2的生姜感病率下降了59.33%和47.33%。處理B與D相比，在貯藏10 d時(shí)接種的兩種病原菌感病率差異不明顯，但B處理貯藏20 d及30 d后感病率都顯著大于同一貯藏期的D處理（P≤0.05，n=3）。

圖3 熏蒸處理與未處理生姜感病率Fig.3 The infection rates of fumigation-treated ginger an d untreated ginger

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)所用材料取材自四川的兩個(gè)地區(qū)，而分離、篩選并鑒定后的病原菌卻是一致的。這說(shuō)明該兩種病原菌可能在四川地區(qū)生姜貯藏期侵染性病害中具有普遍性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生姜貯藏期2 種病原菌分別為鐮刀菌屬和被孢霉屬微生物。澳大利亞學(xué)者Sti rling[13]研究表明鐮刀菌是生姜生長(zhǎng)及貯藏期主要病原菌，并證明該病害主要由土壤傳播，該結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。此外Overy等[14]也認(rèn)為鐮刀菌是生姜貯藏期的主要病原菌。Fatima等[15]在報(bào)道中認(rèn)為與生姜同 為根莖類蔬菜的胡蘿卜和芋頭也易在貯藏期內(nèi)受到鐮刀菌侵染。

早在1971年澳大利亞學(xué)者Pegg和Moffett證明生姜生產(chǎn)中常見(jiàn)的姜瘟病是由細(xì)菌青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacearum）引起的[16]。Hosoki等[17]發(fā)現(xiàn)生姜的軟腐病是由真菌Pythium aphanidermatum引起的，該菌還能引起瓜類、豆類及茄果類腐霉病。1974年P(guān)egg又發(fā)現(xiàn)真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）會(huì)引起生姜莖部腐敗[18]，而真菌Colletotrichum capsici能夠引起生姜炭疽病的病原菌[19]。在生產(chǎn)中常見(jiàn)病原菌僅有尖孢鐮刀菌與本工作分離到的病原菌具有較高的同源性，但進(jìn)化樹(shù)顯示本工作中分離到的ljr4菌株與黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）親緣關(guān)系更近。因此，雖然本實(shí)驗(yàn)中所使用的肉桂精油能較好抑制ljr4菌株生長(zhǎng)繁殖，但 該精油或其他種類精油是否可以用于姜生產(chǎn)中的病害防治還有待進(jìn)一步研究。生姜表面及組織內(nèi)部攜帶有經(jīng)土壤傳播的病原菌，這也是生姜采后致病微生物的主要來(lái)源。但貯藏過(guò)程中的致病微生物并不一定與生產(chǎn)過(guò)程中的致病菌完全相同，這可能是由于生姜生產(chǎn)中常見(jiàn)致病菌都需要較高的溫濕度條件，如30 ℃以上、相對(duì)濕度95%以上，而在貯藏過(guò)程中雖然濕度能夠滿足病原菌的生長(zhǎng)繁殖，但是低溫的環(huán)境對(duì)某些病原菌是不利的。

鐮刀菌屬微生物在生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生毒素[20]。在進(jìn)化樹(shù)分析中l(wèi)jr4與黃色鐮刀菌親緣關(guān)系較近，黃色鐮刀菌已經(jīng)被證明是產(chǎn)生鐮刀菌毒素DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）的主要菌種之一[21]，此外該屬微生物還能產(chǎn)生如玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、串珠鐮刀菌素C和單端孢霉素類等，該類毒素能夠引起人類多種疾病[22]，因此分離自貯藏期生姜的ljr4產(chǎn)生鐮刀菌毒素的可能性較大。ljw2菌株為被孢霉屬微生物，該屬微生物未見(jiàn)產(chǎn)生毒素方面的報(bào)道，但是關(guān)于該屬微生物合成脂肪酸方面的報(bào)道較多[23]，而合成過(guò)程需要大量底物，可能會(huì)使生姜的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)降低，縮短貯藏期。

就兩種病原菌的危害分析，鐮刀菌對(duì)人體健康的潛在危害性更大。生姜被鐮刀菌侵染后發(fā)病癥狀較隱蔽，患病部位在感病初期不能觀察到明顯的菌絲，因此消費(fèi)者可能因誤食受感染的生姜而攝入鐮刀菌毒素。因此在貯藏前及貯藏期控制該類病原菌能夠 有效降低食品安全事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

由于生姜在表皮有水滴的情況下容易腐敗，在其貯藏前及貯藏期殺菌處理中采用熏蒸方式更合理，所以本研究的藥敏性實(shí)驗(yàn)及活體抑菌實(shí)驗(yàn)均采用熏蒸方式進(jìn)行。由于目前尚無(wú)精油抑制被孢霉屬微生物的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)鐮刀菌屬微生物有較好抑制效果的6 種精油進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)[24-25]，分別測(cè)試所選精油對(duì)2 種病原菌的抑菌效果。由于對(duì)經(jīng)濟(jì)性因素的考慮，本實(shí)驗(yàn)采用2 000 μL/L用量進(jìn)行精油有效性的測(cè)試。供試精油中肉桂精油及百里香精油表現(xiàn)出對(duì)病原菌較好的抑制效果。該兩種精油已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于果蔬[26]及肉類[27]保鮮，其中肉桂精油已被證明對(duì)與ljr4同屬的串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）[28]及與ljw2親緣關(guān)系較近的根霉菌（Rhizopus sp.）、毛霉菌（Mucor dimorphosporus）[29]有較強(qiáng)的抑制作用。Alfonso等[30]也在研究中發(fā)現(xiàn)百里香精油對(duì)鐮刀菌屬微生物有較強(qiáng)的抑制作用。這些報(bào)道都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。茶樹(shù)精油對(duì)鐮刀菌抑制不明顯，與Hammer等[31]的報(bào)道不符，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所使用的精油用量較低所致。

肉桂與百里香精油在2 000 μL/L用量下對(duì)ljw2及l(fā)jr4菌株生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%，其他供試精油在該用量下不能同時(shí)抑制兩種病原菌，且抑制單一病原菌的效果并未優(yōu)于肉桂精油及百里香精油，所以本實(shí)驗(yàn)在藥敏性實(shí)驗(yàn)中僅比較了病原菌對(duì)該2種精油的敏感程度。由于保持生姜表皮干燥及獨(dú)特氣味的需要，藥敏性實(shí)驗(yàn)中采用熏蒸法進(jìn)行抑菌處理。

離體條件下肉桂精油熏蒸處理對(duì)ljr4及l(fā)jw2菌株的最低殺菌用量分別為125 μL/L和500 μL/L。在活體實(shí)驗(yàn)中以此用量熏蒸處理3 d后的生姜感病率顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明熏蒸處理能夠有效抑制接種于生姜的病原菌。但熏蒸處理組在30 d時(shí)感病率仍分別為11%和9.67%，說(shuō)明熏蒸處理后的生姜病原菌并未被完全抑制。Farbood等[32]研究發(fā)現(xiàn)抑制食品上的病原菌需要的精油用量大于體外抑菌所需精油用量。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，這可能是由于病原菌在其原本宿主上有更好的適應(yīng)性，因此病原菌對(duì)殺菌劑的耐受性有所增強(qiáng)。但這并不能說(shuō)明肉桂精油熏蒸在活體條件下效果不佳，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所得到的感病率是基于接種病原菌后的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而實(shí)際貯藏中使用的是經(jīng)挑選后健康的生姜，其表面組織的單位體積含菌用量遠(yuǎn)小于接種用量。

所以該用量的熏蒸理論上適用于生姜?dú)⒕幚?。在?shí)際情況下，該用量的肉桂精油熏蒸處理更適合于貯藏前的殺菌操作，熏蒸時(shí)間為3～4 d。如果在貯藏期長(zhǎng)期封閉的環(huán)境中使用，由于處理時(shí)間很長(zhǎng)，可以降低用量進(jìn)行熏蒸操作。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從貯藏中的生姜感病部位分離出的ljr4及l(fā)jw2真菌菌株表現(xiàn)出致病性，通過(guò)18S rDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)病原菌分別屬于鐮刀菌屬及被孢霉屬。其中l(wèi)jr4菌株與黃色鐮刀菌親緣關(guān)系較近，產(chǎn)生鐮刀菌毒素的可能性較大，存在潛在的食品安全隱患。在已知對(duì)鐮刀菌屬有較強(qiáng)抑制作用的6種精油中，ljw2只對(duì)百里香及肉桂精油較敏感。藥敏性實(shí)驗(yàn)證明肉桂精油熏蒸抑制該2種病原菌效果較好，肉桂精油熏蒸處理對(duì)ljr4及l(fā)jw2菌株的最低殺菌用量分別為125 μL/L及500 μL/L。活體抑菌實(shí)驗(yàn)中125 μL/L用量肉桂精油熏蒸能降低接種ljr4菌株生姜的感病率至對(duì)照的1/6；500 μL/L用量肉桂精油熏蒸能降低接種ljw2菌株生姜的感病率至對(duì)照的1/7。肉桂精油是一種適用于生姜貯藏的熏蒸劑。

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Isolation, Identification and Inhibition of Pathogens from Mature Ginger during Storage

LIU Ji1,2, YAN Jing2, HE Jing-liu2, DONG Hong-min2, GUO Fei2, XIONG Ya-bo2, HUANG Ying2, QIN Wen2,*
(1. Agriculture Products Research Institute, Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Chengdu 611130, China; 2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

This research was intended to isolate, purify, and identify the pathogens which cause ginger rotting during storage, to screen essential oils for controlling the pathogenic isolates, and to test their effectiveness. In this work, ljw2 and ljr4 were identif i ed as pathogens through isolation, purif i cation, and pathogenicity tests. The results of 18S rDNA sequence analysis showed that these fungi belonged to the genera Fusarium and Mortierella. Six essential oils, based on the pathogen genera, were investigated for their activity to control these pathogens. As results, cinnamon and thyme oil showed complete inhibitory effect on all pathogens at a concentration of 2 000 μL/L. Cinnamon oil showed higher antifungal activity in the drug sensitivity test. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of cinnamon oil against these two pathogens were 64 and 32 μL/L, respectively. The minimal fungicidal concentrations of cinnamon oil against the pathogens were 125 and 500 μL/L, respectively. Compared with untreated samples, the infection rates of fumigation treatment samples declined by 59.33% (ljr4) and 47.33% (ljw2), respectively. Cinnamon oil seems to be a promising potential fumigant.

Fusarium; Mortierella; 18S rDNA; cinnamon oil; antibacterial effect

TS205.9

A

1002-6630（2014）18-0172-06

10.7506/spkx1002-6630-201418034

2013-12-26

劉繼（1984—），男，博士，研究方向?yàn)楣呒庸ぜ百A藏。E-mail：liujidemail@sina.com

*通信作者：秦文（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸ぜ百A藏。E-mail：qinwen1967@aliyun.com.cn