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        蘋果渣發(fā)酵過程中游離氨基酸和揮發(fā)性香氣成分分析

        2014-02-27 08:39:50呂春茂孟憲軍徐境一
        食品科學 2014年18期

        呂春茂,劉 暢,孟憲軍,鄭 鵬,徐境一

        (沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧 沈陽 110866)

        蘋果渣發(fā)酵過程中游離氨基酸和揮發(fā)性香氣成分分析

        呂春茂,劉 暢,孟憲軍,鄭 鵬,徐境一

        (沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧 沈陽 110866)

        為提高蘋果渣的利用價值,采用固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵蘋果渣制備單細胞蛋白,并通過氨基酸自動分析儀及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蘋果渣制備單細胞蛋白的營養(yǎng)及風味進行分析。結(jié)果表明:蘋果渣發(fā)酵前后游離氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL,呈味氨基酸含量由2.73 mg/mL增加至11.45 mg/mL,7 種必需氨基酸含量由0.87 mg/mL增加至5.33 mg/mL;蘋果渣經(jīng)過發(fā)酵后揮發(fā)性香氣成分由發(fā)酵前的17 種增加到38 種,芳香族化合物的種類及含量有所增加,并新產(chǎn)生了酯類、呋喃類、含氮類化合物;發(fā)酵后蘋果渣香氣濃郁,風味得到顯著改善。

        蘋果渣;固態(tài)發(fā)酵;游離氨基酸;揮發(fā)性香氣成分

        我國的蘋果加工規(guī)模是世界上最大的,每年因蘋果加工而產(chǎn)生的鮮果渣達100萬t[1],除少量蘋果渣被用于生產(chǎn)果膠、檸檬酸、膳食纖維及食用菌培養(yǎng)基質(zhì)[1]外大部分被廢棄,既污染環(huán)境又使其中富含的大量有機營養(yǎng)白白浪費。為了提高蘋果渣的利用價值,人們利用微生物發(fā)酵增加蘋果渣中的蛋白質(zhì)含量[2]。同未發(fā)酵的蘋果渣相比,發(fā)酵蘋果渣中富含蛋白質(zhì)、脂肪、核酸、VC和無機鹽[3-4],有較好的香味和性能,具有較高營養(yǎng)價值[5]。目前,對發(fā)酵蘋果渣的研究主要集中于菌體蛋白的利用,而發(fā)酵蘋果渣中氨基酸及產(chǎn)香特性的分析鮮有報道。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,其種類及含量直接影響發(fā)酵蘋果渣的營養(yǎng)價值及風味,而蘋果渣發(fā)酵后揮發(fā)性香氣成分也是判斷發(fā)酵蘋果渣風味的重要指標。發(fā)酵蘋果渣主要的用途是分離制備菌體蛋白,進而生產(chǎn)人造食用蛋白,這對于補充和豐富人類的蛋白質(zhì)營養(yǎng)具有重要戰(zhàn)略意義,其次也可以作為飼料添加劑,促進畜牧業(yè)的發(fā)展。本實驗利用混合菌種發(fā)酵寒富蘋果渣,采用氨基酸自動分析儀對鮮果渣及發(fā)酵蘋果渣中游離氨基酸的種類及含量進行測定,并采用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)[6]聯(lián)用技術(shù)檢測發(fā)酵前、后蘋果渣的揮發(fā)性香氣成分,用以研究發(fā)酵過程對蘋果渣營養(yǎng)價值及風味的影響,為更好開發(fā)利用發(fā)酵蘋果渣提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        寒富蘋果 沈陽市東陵區(qū)深井子金德勝果園。

        蘋果渣:寒富蘋果鮮榨蘋果渣,在60 ℃烘干48 h,用粉碎機粉碎,過60 目篩,備用;培養(yǎng)基:蘋果渣料水比1∶3(m/m),121 ℃滅菌20 min;菌種:黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母,均來自本實驗室;菌種活化:將黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母進行斜面活化,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)固體培養(yǎng)基活化,30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h;擴大培養(yǎng):挑取經(jīng)過活化的菌種,制成菌懸液,黑曲霉在50 mL PDA固體培養(yǎng)基,熱帶假絲酵母和啤酒酵母在100 mL PDA液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),在30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

        1.2 儀器與設備

        滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;電熱干燥培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;L-8800型氨基酸自動分析儀、離心機 日本日立公司;7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;多功能粉碎機永康帥通工具有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 發(fā)酵蘋果渣的制備

        在制備好的蘋果渣培養(yǎng)基中,按體積分數(shù)5%的接種量接入混合菌種,混合菌種包括黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母,按照1∶3∶3(V/V)混合,30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。1.3.2 游離氨基酸的測定

        1.3.2.1 樣品制備

        1 g發(fā)酵蘋果渣,加10 mL蒸餾水,調(diào)節(jié)pH值為7.5,加質(zhì)量分數(shù)15%的混合酶(木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比為1∶2),55 ℃酶解3 h,8 000 r/min離心20 min,按1∶1(V/V)加入質(zhì)量分數(shù)5%磺基水楊酸,充分振蕩,12 000 r/min離心20 min,取上清液5 mL于蒸發(fā)皿中蒸干。用10 mL 6 mol/mL鹽酸將樣品由蒸發(fā)皿中轉(zhuǎn)移至水解管內(nèi),抽真空、封管,110 ℃水解24 h。冷卻、開瓶、過濾、定容至50 mL,取5 mL于蒸發(fā)皿中蒸干,冷卻后加2.5 mL 0.02 mol/mL鹽酸于蒸發(fā)皿中將蒸干樣溶解,過0.22 μm濾膜后進樣。

        1.3.2.2 氨基酸分析儀色譜條件

        色譜柱:2622C陽離子型交換樹脂(4.6 mm× 6.0 mm);進樣量20 μL;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液流速0.4 mL/min;分析柱柱溫50 ℃;泵1泵壓9.1×106Pa;茚三酮溶液流速0.35 mL/min;反應柱柱溫136 ℃,泵2泵壓1.1×106Pa;紫外檢測器在脯氨酸440 nm波長處檢測,其他氨基酸在570 nm波長處檢測。

        1.3.3 揮發(fā)性香氣成分的測定

        1.3.3.1 GC-MS樣品制備

        將發(fā)酵完成的蘋果渣4 000 r/min離心20 min,上清液用二氯甲烷萃取,將萃取液30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL備用。

        1.3.3.2 GC-MS條件

        GC條件:色譜柱:DB-1701(30 m×0.32 mm,0.25 μm);進樣口溫度280 ℃;升溫程序:40 ℃保持5 min,然后以10 ℃/min升至110 ℃,再以5 ℃/min 升至130 ℃,最后以10 ℃/min升至230 ℃保持5 min;載氣He;進樣量1 μL;分流進樣,分流比50∶1。

        MS條件:電子電離(electron ionization,EI)源;電子能量70 eV;溶劑延遲3.00 min;質(zhì)量掃描范圍35.0~400.0 u。

        1.3.3.3 數(shù)據(jù)處理

        利用NIST05標準質(zhì)譜庫檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),參考文獻資料與標準譜圖確認各揮發(fā)性香氣物質(zhì)的化學組分,按照峰面積歸一化法計算出各組分的相對含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 游離氨基酸的含量及組成

        游離氨基酸的標準圖譜、新鮮蘋果渣及發(fā)酵蘋果渣中游離氨基酸圖譜分別如圖1、2、3所示,新鮮蘋果渣及發(fā)酵蘋果渣中游離氨基酸的測定結(jié)果如表1所示。由表1可知,發(fā)酵過程增加了蘋果渣中游離氨基酸的種類及含量,游離氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL。發(fā)酵蘋果渣中谷氨酸的含量最高達2.53 mg/mL,其次為天冬氨酸、賴氨酸、丙氨酸含量分別為2.4、1.13、1.01 mg/mL,含量較少的氨基酸是半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸,含量分別為0.21、0.27、0.37 mg/mL。

        新鮮蘋果渣中除色氨酸以外的其他7 種必需氨基酸的總含量為0.87 mg/mL,發(fā)酵蘋果渣中7 種必需氨基酸的總含量為5.33 mg/mL,這表明,發(fā)酵過程也顯著提高了必需氨基酸的含量,使蘋果渣更具營養(yǎng)價值。

        表1 新鮮蘋果渣及發(fā)酵蘋果渣中游離氨基酸的含量Table 1 Free amino acid contents of apple pomace and fermented apple pomace

        氨基酸是食物味道的主要貢獻者[7],其本身會呈現(xiàn)出酸、甜、苦、鮮等各種味道[8],甜味類氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸[9],新鮮蘋果渣中甜味類氨基酸

        總含量為1.07 mg/mL,發(fā)酵蘋果渣中甜味類氨基酸總含量為3.57 mg/mL;鮮味類氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸[9],新鮮蘋果渣中鮮味氨基酸總含量為1.28 mg/mL,發(fā)酵蘋果渣中鮮味氨基酸總含量為4.93 mg/mL;呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸[10],新鮮蘋果渣中苦味氨基酸總含量為0.38 mg/mL,發(fā)酵蘋果渣中苦味氨基酸總含量為2.95 mg/mL。這些呈味氨基酸的含量由2.73 mg/mL增加到11.45 mg/mL。發(fā)酵蘋果渣中含量較高的呈味氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸,因此可認為以上3 種氨基酸為發(fā)酵蘋果渣的特征性風味物質(zhì)。

        圖1 游離氨基酸標準圖譜Fig.1 Standard spectrum of free amino acids

        圖2 新鮮蘋果渣中游離氨基酸測定圖譜Fig.2 Spectrum of free amino acids in apple pomace

        圖3 發(fā)酵蘋果渣中游離氨基酸測定圖譜Fig.3 Spectrum of free amino acids in fermented apple pomace

        2.2 GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測揮發(fā)性香氣成分

        圖4和圖5為蘋果渣發(fā)酵前和發(fā)酵后GC-MS總離子流量圖,分析鑒定結(jié)果見表2。其中發(fā)酵前蘋果渣的揮發(fā)性香氣成分共17 種,包括醇類1 種、醛類2 種、酸類2 種、芳香族7 種和烷烴類5 種,其相對含量分別為4.02%、6.49%、6.4%、2.7%和2.24%;蘋果渣發(fā)酵后鑒定出38種揮發(fā)性香氣成分,包括醇類1種、醛類1種、酸類1種、酯類7種、芳香族10種、烷烴類9種、含氮化合物5種、呋喃類3種、噻吩類1種,其相對含量分別為6.55%、1.48%、1.4%、2.42%、10.94%、4.85%、67.56%、3.37%和0.36%。

        通過分析蘋果渣發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分的種類及含量,發(fā)現(xiàn)蘋果渣發(fā)酵后酸類物質(zhì)種類及相對含量均減少,乙酸、己酸轉(zhuǎn)化成了其他香氣成分,對蘋果渣的風味影響較小;發(fā)酵后新產(chǎn)生了7 種酯類物質(zhì)且乙酸乙酯的相對含量最高,達到總量的1.36%,而乙酸乙酯是具有較強水果氣味的酯類成分[11],因此乙酸乙酯對蘋果渣發(fā)酵后風味的增強具有重要貢獻;蘋果渣發(fā)酵后產(chǎn)生了3 種呋喃類物質(zhì),分別是丁內(nèi)酯、糠醇、1-(2-呋喃)-1,2-乙二醇,前2 種物質(zhì)具有甜香、焦糖香、面包香、咖啡香及堅果香味[12-14],且香味持久,因此丁內(nèi)酯、糠醇也是蘋果渣發(fā)酵制品重要的特征風味物質(zhì);蘋果渣發(fā)酵后較發(fā)酵前芳香類物質(zhì)的種類及含量都有所增加,其中變化明顯的為苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙酮,而苯乙醇是應用較為廣泛的一種食用香料,具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣[15]及新鮮的面包和清甜的蜂蜜香氣[16],苯甲醇具有花香氣味[17],苯

        甲醛具有堅果香氣[14],苯乙酮具有堅果及水果香氣[16],因此上述芳香類物質(zhì)也是發(fā)酵蘋果渣香氣濃郁重要的特征風味物質(zhì)。

        發(fā)酵過程產(chǎn)生5 種含氮化合物,分別為吲哚、十六酰胺、順-9-十八碳烯酰胺、十五烷腈、齊墩果腈,其中吲哚具有糞臭和動物氣息[16],但其含量較低,所以它的存在不會使發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)生令人不愉快的霉臭氣味。順-9-十八碳烯酰胺相對含量為38.96%,是所檢測出香氣成分中含量最高的,其次是齊墩果腈,相對含量達23.46%。順-9-十八碳烯酰胺在紅象牙芒果[18]中檢測到,齊墩果腈在松茸[19]及蠶蛹[20]中檢測到,但目前還沒有在發(fā)酵蘋果渣中鑒定到順-9-十八碳烯酰胺及齊墩果腈的相關(guān)報道,并且沒有對這2 種物質(zhì)香氣特征的描述,因此,順-9-十八碳烯酰胺及齊墩果腈對發(fā)酵蘋果渣氣味產(chǎn)生的作用還有待進一步研究。

        表2 發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)生主要香氣成分Table 2 Volatile aroma components of fermented apple pomace

        圖4 未發(fā)酵蘋果渣GC-MS總離子流量圖Fig.4 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of unfermented apple pomace

        圖5 發(fā)酵蘋果渣GC-MS總離子流量圖Fig.5 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of fermented apple pomace

        3 結(jié) 論

        發(fā)酵蘋果渣中總游離氨基、必需氨基酸及呈味氨基酸的種類及含量較高,均顯著高于未發(fā)酵蘋果渣氨基酸的種類及含量,增加了蘋果渣的營養(yǎng)價值。發(fā)酵過程有效地提高了蘋果渣香氣濃度及香味種類,蘋果渣的風味得到明顯改善。

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        Analysis of Free Amino Acids and Aroma Components in Fermented Apple Pomace

        Lü Chun-mao, LIU Chang, MENG Xian-jun, ZHENG Peng, XU Jing-yi
        (College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

        The contents and kinds of free amino acids (FAAs) in apple pomace and fermented apple pomace were determined by amino acid analyzer. The aroma components in the unfermented and fermented samples were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results showed that the content of FAAs was increased from 3.25 to 15.68 mg/mL, and the content of flavor amino acids was increased from 2.73 to 11.45 mg/mL after fermentation. Fermented apple pomace contained 7 essential amino acids and their total content was increased from 0.87 to 5.33 mg/mL. Seventeen and thirty eight volatile compounds were identified in the unfermented and fermented apple pomace, respectively. The types and contents of aromatic substances were increased. In the fermented apple pomace, esters, furans, and nitrogen-containing substances were produced. Fermentation improved the flavor of apple pomace.

        apple pomace; fermention; free amino acids; volatile aroma components

        TS255.36

        A

        1002-6630(2014)18-0146-05

        10.7506/spkx1002-6630-201418029

        2013-12-28

        沈陽市大型儀器共享項目(4130199-1102-01083909001)

        呂春茂(1970—),男,副教授,博士,研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail:bt_lcm@126.com

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