楊 健，袁春龍,2,*，任亞梅，方玉飛，楊曉雁，張世杰

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

葡萄籽原花青素的提取及其抗紫外線活性測(cè)定

楊 健1，袁春龍1,2,*，任亞梅3，方玉飛1，楊曉雁1，張世杰1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

采用快速溶劑萃取法提取葡萄籽脫脂粉中的原花青素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，最終獲得葡萄籽原花青素提取物（grape seed proanthocyanidins extracts，GSPE）干粉。快速簡(jiǎn)便地測(cè)定不同質(zhì)量濃度的GSPE乙醇溶液的防曬系數(shù)以反映抗紫外線活性，并探究GSPE乙醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)其抗紫外線活性的影響。結(jié)果表明，快速溶劑萃取法以乙醇做安全提取劑，最佳提取參數(shù)為萃取壓強(qiáng)1 100 psi、萃取時(shí)間14 min、萃取溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下，提取原花青素得率為71.62 mg/g，純度為41.53%；1 000 μg/mL的原花青素提取物乙醇溶液的防曬系數(shù)值達(dá)24.755 6±0.759 9，具有顯著抗紫外線活性；GSPE抗紫外線活性與質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈顯著正相關(guān)。

抗紫外線；葡萄籽原花青素提取物；紫外分光光度計(jì)法；防曬系數(shù)；快速溶劑萃取法

原花青素是由黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成的一類多酚化合物，具有特殊抗氧活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)得到應(yīng)用，它可以顯著改善因高血糖癥引起的肝損傷[1]，對(duì)重度抑郁癥[2]的治療有一定的作用。此外，原花青素還可以保護(hù)皮膚不受紫外線傷害，降低皮膚癌發(fā)病的幾率[3-7]，具備美白及抑制黑色素瘤生長(zhǎng)[8-9]、保濕等美容效果，具有開發(fā)成防紫外線功效化妝品的潛力。目前，化妝品領(lǐng)域常用防曬劑的還是以甲氧基肉桂酸乙基己酯[10]、丁基甲氧基二苯甲?；淄閇11]等化學(xué)防曬劑為主等，但是這類防曬劑可能引發(fā)光接觸致敏和光致敏[12-14]，研究開發(fā)天然植物防曬劑的需要?jiǎng)t更為迫切。

目前提取葡萄籽原花青素物的方法主要有超聲波提取、微波提取等，但是耗費(fèi)溶劑時(shí)間而且可能降低成分活性。本研究采用快速溶劑萃取法，大大降低了溶劑耗

費(fèi)，縮短提取時(shí)間，并且簡(jiǎn)化了樣品前處理程序[15-17]，以乙醇作為提取溶劑更加安全，在合理選擇溶劑體積分?jǐn)?shù)、萃取時(shí)間、溫度、壓強(qiáng)的基礎(chǔ)上，可以快速獲得安全的葡萄籽原花青素提取物。

我國(guó)化妝品衛(wèi)生規(guī)范2007版及歐洲化妝品盥洗用品及香水協(xié)會(huì)關(guān)于防曬化妝品防曬效果的評(píng)價(jià)方法是人體法，但是人體法操作復(fù)雜，可變因素繁多，是針對(duì)防曬霜產(chǎn)品的評(píng)價(jià)方式，不完全適用于防曬劑篩選階段的科研過程。本研究采用體外紫外分光光度法測(cè)定防曬系數(shù)（sun-protection factor，SPF）值[18-19]，既簡(jiǎn)便快速，又直觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)葡萄籽原花青素乙醇提取物防曬效果，可用于產(chǎn)品開發(fā)過程中抗紫外線效果的分析，為其以后在化妝品領(lǐng)域應(yīng)用提供指導(dǎo)。迄今為止，關(guān)于體外分光光度計(jì)法測(cè)定葡萄籽原花青素提取物（grape seeds proanthocyanidins extracts，GSPE）抗紫外線活性，及其與相應(yīng)質(zhì)量濃度間具體關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽取自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，自然曬干。

乙醇、石油醚、濃鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；香草醛廣東汕頭市西隴化工廠；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；微型植物試樣粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；ASE快速溶劑萃取儀 美國(guó)戴安公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；索氏提取器 上海精密儀器有限公司；LGJ-10D 型真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽脫脂粉的制備

將自然晾干葡萄籽40 ℃干燥2 h，后-20 ℃冷凍30 min，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎，過篩得到葡萄籽粉，于索氏提取器中以石油醚為脫脂溶劑，水浴溫度70～80 ℃，浸提24 h。后取出干燥得脫脂粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鹽酸香草醛法測(cè)定原花青素含量

采用香草醛-濃鹽酸法[20-22]，以原花青素為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=1.657 9x+0.011 3，R2=0.999 5，其中，y為吸光度，x為原花青素質(zhì)量濃度/（mg/mL），線性質(zhì)量濃度范圍為0.125～0.625 mg/mL。精密吸取葡萄籽提取液，定容至一定體積V1，再稀釋d 倍，再取稀釋后的樣液1 mL，加入5 mL顯色劑，搖勻，避光，30 ℃水浴30 min，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程查得原花青素質(zhì)量濃度C/（μg/mL）。

純度測(cè)定：將葡萄籽提取液冷凍干燥，稱取1.0 mg干粉，用甲醇定容至一定體積V2，再取稀釋后的樣液1 mL，加入5 mL顯色劑，搖勻，避光，30 ℃水浴30 min，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算原花青素質(zhì)量濃度C/（μg/mL）。

式中：M1為葡萄籽脫脂粉質(zhì)量/g；M2為葡萄籽原花青素提取物干粉質(zhì)量/g。

1.3.3 快速溶劑萃取法提取原花青素單因素試驗(yàn)

選取乙醇為提取溶劑，分別考察萃取壓強(qiáng)、萃取時(shí)間、萃取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個(gè)因素對(duì)原花青素提取率的影響。

1.3.4 快速溶劑萃取法提取原花青素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取壓強(qiáng)、時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)中對(duì)原花青素影響顯著的因素為考察因素，每個(gè)因素?cái)M定3 個(gè)水平，選用正交試驗(yàn)表，以原花青素得率作為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選最佳快速溶劑提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 原花青素的快速溶劑萃取正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 體外紫外分光光度法測(cè)定SPF

體外分光光度法測(cè)定SPF是基于光譜學(xué)的方法，測(cè)定樣品在特定波長(zhǎng)下的紫外透光率，并借助太陽(yáng)光譜強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)來獲得相應(yīng)的SPF值。Mansur等[23]開發(fā)了一個(gè)非常簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)方程代替Sayre等[24]的體外方法，利用紫外線分光光度法和式（3）[23-24]進(jìn)行計(jì)算。

式中：CF為校正因子（10）；Iλ為太陽(yáng)光譜強(qiáng)度，EEλ為波長(zhǎng)λ下輻射的紅斑效應(yīng)，Aλ為在波長(zhǎng)λ波長(zhǎng)下吸光度。EEλ× Iλ是常量，它們由Sayre等[24]測(cè)定。

精確稱取GSPE干粉1.000 0 g，以乙醇定容至100 mL，超聲波振蕩5 min后，以0.45 μm的微孔濾膜過濾，最初的10 mL濾液棄去，得到10 000 μg/mL母 液；取母液以乙醇稀釋，分別得到10、100、300、500、700、900、1 000、5 000 μg/mL待測(cè)液。使用紫外分光光度計(jì)，在290～320 nm，每隔5 nm測(cè)定3 次吸光度，1 cm石英比色皿，乙醇作為空白對(duì)照。應(yīng)用Mansur方程計(jì)算SPF[25-29]。

表2 SPF計(jì)算規(guī)范系數(shù)常量Table 2 Normalized product function used in the calculation of SPF

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 萃取壓強(qiáng)對(duì)原花青素得率的影響

在5 種不同萃取壓強(qiáng)下進(jìn)行快速溶劑萃取，分別為800、1 000、1 200、1 400、1 600 psi，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、時(shí)間10 min、溫度70 ℃條件下循環(huán)兩次使用快速溶劑萃取儀靜態(tài)萃取，結(jié)果見圖1。

圖1 萃取壓強(qiáng)對(duì)原花青素得率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of proanthocyanidins

由圖1可見，萃取壓強(qiáng)1 200 psi時(shí)為提取的原花青素最多，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素得率降低，可能是過高壓強(qiáng)導(dǎo)致原花青素裂解，故選擇1 200 psi為宜。同時(shí)由單因素方差分析可知P=0.040 5＜0.05，說明此因素在試驗(yàn)水平內(nèi)影響顯著。

2.1.2 萃取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

在5 種不同時(shí)間下進(jìn)行快速溶劑萃取，分別為5、8、11、14、17 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、壓強(qiáng)1 000 psi、溫度70 ℃條件下循環(huán)兩次使用快速溶劑萃取儀靜態(tài)萃取，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

由圖2可見，萃取時(shí)間從5～14 min時(shí)原花青素得率明顯升高，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，反而，原花青素得率降低，可能是其他干擾物質(zhì)增多。故選擇14 min為宜，同時(shí)由單因素方差分析知P=0.000 0＜0.05，說明此因素在試驗(yàn)水平內(nèi)影響顯著。

2.1.3 萃取溫度對(duì)原花青素得率的影響

在5 種不同溫度下進(jìn)行快速溶劑萃取，分別為40、50、60、70、80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、壓強(qiáng)1 000 psi、時(shí)間10 min條件下循環(huán)兩次使用快速溶劑萃取儀靜態(tài)萃取，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of proanthocyanidins

由圖3可見，萃取溫度為70 ℃提取的原花青素最多，隨著萃取溫度升高，原花青素得率降低，可能溫度過高導(dǎo)致原花青素結(jié)構(gòu)遭破壞。選擇70 ℃為宜。同時(shí)由單因素方差分析知P=0.000 2＜0.05，說明此因素在試驗(yàn)水平內(nèi)影響顯著。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

采用5 種不同乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行研究，分別為60%、70%、80%、90%、100%，萃取時(shí)間10 min，壓強(qiáng)1 000 psi、溫度70 ℃條件下循環(huán)兩次使用快速溶劑萃取儀靜態(tài)萃取，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

由圖4可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，原花青素得率先升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，得率下降，可能由于一些醇溶性雜質(zhì)成分溶出增多，干擾因素隨之增大，且考慮節(jié)省溶劑減低污染，故選擇80%為宜，同時(shí)由單因素方差分析知P=0.003 6＜0.05，說明此因素在試驗(yàn)水平內(nèi)影響顯著。

2.2 正交試驗(yàn)

對(duì)萃取壓強(qiáng)、萃取時(shí)間、萃取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)

進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以確定最佳的提取工藝條件。對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析和方差分析，分析結(jié)果（表3、4）表明，4 種考察因素對(duì)GPC提取率影響程度高低順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即萃取時(shí)間＞萃取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞萃取壓強(qiáng)，其中萃取壓強(qiáng)對(duì)提取率影響在0.05水平上，差異不顯著，其余3 個(gè)因素均有顯著性。其適宜提取工藝組合：A1B2C2D1即萃取壓強(qiáng)1 100 psi、萃取時(shí)間14 min、萃取溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。此工藝條件下原花青素得率為71.62 mg/g，純度為41.53%。

表3 葡萄籽原花青素提取工藝正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal array design and range analysis

表4 葡萄籽原花青素提取工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance for the yield of proanthocyanidins

2.3 不同質(zhì)量濃度的葡萄籽原花青素的抗紫外線能力測(cè)定

表5 葡萄籽原花青素乙醇提取物的SPF測(cè)定Table 5 SPF of GSPE

SPF是定量測(cè)量防曬劑有效性的標(biāo)準(zhǔn)。體外法的防曬系數(shù)測(cè)定在產(chǎn)品開發(fā)階段用于防曬劑篩選實(shí)驗(yàn)很有效，是防曬系數(shù)測(cè)量人體實(shí)驗(yàn)的有效補(bǔ)充。本研究中，使用紫外分光光度法，測(cè)得GSPE不同質(zhì)量濃度的醇溶液在290～320 nm，每隔5 nm測(cè)定3 次吸光度，應(yīng)用Mansur方程計(jì)算SPF，結(jié)果如表5所示。

圖5 葡萄籽原花青素提取物質(zhì)量濃度對(duì)SPF的影響（10～10 000 μg/mL）Fig.5 Effect of GSPE concentration on SPF (10-10 000 μgg//mmLL)

圖6 葡萄籽原花青素提取物質(zhì)量濃度對(duì)SPF的影響（10～1 000 μg/mL）Fig.6 Linear relationship between SPF and GSPE concentration (10-1 000 μg/mL)

圖7 100～10 000 μg/mL GSPE在的吸光度分布Fig.7 Absorbance distribution of 100-10 000 μgg//mmLL GSPE from 290 nm to 320 nm

在不同原花青素組分質(zhì)量濃度下，用SPF值考察它們的紫外線吸收活性（圖5）。在質(zhì)量濃度較低（10～1 000 μg/mL）的情況下（圖6），其質(zhì)量濃度與抗紫外線活性呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，y = 0.021 6x + 3.902 1，R2=0.989 5，大于其臨界相關(guān)系數(shù)，呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。即隨著質(zhì)量濃度的增加，紫外線吸收效果逐漸上升。在原花青素質(zhì)量濃度為1 000～10 000 μg/mL時(shí)（圖5），紫外線吸收效果的增幅大大減緩，這可能是由于隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)紫外線的吸收作用逐漸達(dá)到飽和。另外，原花青素質(zhì)量濃度為1 000～10 000 μg/mL時(shí)（圖7），雖然300、305、310 nm

三點(diǎn)的吸光度隨質(zhì)量濃度變化增加不明顯，但在290、295、315、320 nm波長(zhǎng)處的吸收能力還是有較大提升，但是由于這些波長(zhǎng)在Mansur方程中的權(quán)重系數(shù)很小，因而計(jì)算出的SPF值沒有顯著提高。

3 結(jié) 論

3.1 葡萄籽制備成脫脂粉后，在萃取壓強(qiáng)1 100 psi、萃取時(shí)間14 min、萃取溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%條件下采用快速溶劑萃取法提取，原花青素得率為71.62 mg/g，純度為41.53%。

3.2 GSPE乙醇溶液質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，SPF達(dá)24.755 6±0.759 9，表示具有顯著抗紫外線活性，在較低質(zhì)量濃度10～1 000 μg/mL時(shí)，GSPE的SPF與質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)，但是高質(zhì)量濃度時(shí)SPF升高達(dá)到飽和。為葡萄籽提取物的具體抗紫外線功能提供一定定量參考信息，有利于開發(fā)其作為中高強(qiáng)度防曬產(chǎn)品防曬劑。

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Extraction and Anti-Ultraviolet Activity of Proanthocyanidins from Grape Seed

YANG Jian1, YUAN Chun-long1,2,*, REN Ya-mei3, FANG Yu-fei1, YA NG Xiao-yan1, ZHANG Shi-jie1
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniclture, Yangling 712100, China; 3. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

An accelerated solvent extractor (ASE) was used to extract proanthocyanidins from defatted grape seed powder. Grape seed proanthocyanidin extracts (GSPE) were obtained under the optimal operating conditions established by one factor-at-a-time and orthogonal array design methods. We evaluated the anti-ultraviolet (UV) activity of GSPE at various concentrations in ethanol by determining sun-protection factor (SPF) by a rapid and simple method with the aim of clarifying the concentration-effect relationship. The optimal extraction conditions were found to be 14 min of extraction at 70 ℃with 70% ethanol/water mixture (V/V) at a pressure of 1 100 psi. Under these conditions, the yield and purity of GSPE were 71.62 mg/g and 41.53%, respectively. The SPF of 1 000 μg/mL proanthocyanidins in ethanol was 24.755 6 ± 0.759 9, which confirmed the anti-UV activity of GSPE. A significant positive concentration-effect relationship was found within a certain concentration range.

anti-UV activity; grape seed proanthocyanidin extracts (GSPE); ultraviolet spectrophotometry method; sunprotection factor (SPF); accelerated solvent extractor (ASE)

TS201.2

A

1002-6630（2014）18-0069-05

10.7506/spkx1002-6630-201418013

2013-10-10

；西北農(nóng)林科技大學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2013017）

楊?。?988—），女，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫苹瘜W(xué)。E-mail：yangjane10@163.com

*通信作者：袁春龍（1969—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫苹瘜W(xué)。E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn