趙麗麗，蔡露茜，葉競(jìng)雄，馮 潔，趙玉玲,*

（1.浙江中鼎檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 義烏 322000；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

表面活性劑SDS輔助微波提取金佛手總黃酮工藝及抗氧化活性評(píng)價(jià)

趙麗麗1，蔡露茜2，葉競(jìng)雄2，馮 潔2，趙玉玲2,*

（1.浙江中鼎檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 義烏 322000；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別研究了表面活性劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)金佛手總黃酮提取量的影響。確定微波提取最佳工藝條件為表面活性劑SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波功率50 W、微波時(shí)間30 s，在此工藝條件下金佛手總黃酮提取量為18.706 0 mg/g。金佛手總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為79.15%和65.25%，其抗氧化活性略低于槲皮素。結(jié)果表明，金佛手總黃酮具有顯著抗氧化活性，可作為抗氧化劑應(yīng)用到食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

金佛手總黃酮；表面活性劑SDS；微波提取；抗氧化活性

佛手為蕓香科柑橘屬植物，主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶，在我國(guó)浙江、福建、廣東、四川、云南等地均有栽培[1]?！敖鸱鹗帧笔侵府a(chǎn)于浙江金華的佛手。佛手主要化學(xué)成分為香豆素類(lèi)和黃酮類(lèi)[2-4]，具有舒肝和胃、行氣止痛、祛濕化痰等功效。黃酮類(lèi)是指以黃酮（2-苯基-苯并-g-吡喃酮）為母體的一大類(lèi)化合物，廣泛分布于植物界，是許多中草藥的有效成分。黃酮類(lèi)化合物作為天然抗氧化劑中重要的一部分，其抗氧化方面的研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展[5-10]。目前對(duì)金佛手的研究主要集中在化學(xué)成分、揮發(fā)油及佛手多糖等方面[11-12]，而對(duì)金佛手總黃酮的提取工藝及抗氧化活性評(píng)價(jià)則幾乎空白。

表面活性劑輔助微波提取植物中的總黃酮已見(jiàn)報(bào)道[13-15]，提取得到的總黃酮具有較強(qiáng)清除自由基的能力[16-18]，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[19]，利用表面活性劑十二烷基磺酸鈉輔助微波提取金佛手中的總黃酮，采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，旨在為金佛手的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

外觀如觀音手，色澤金黃油亮的成熟佛手鮮果，購(gòu)自浙江金華花卉市場(chǎng)。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazolingsulfonic acid)，ABTS）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、二氧化錳均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自動(dòng)三重純水蒸餾器燒制蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；Lambda25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；KD23B-DA美的微波爐 佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；R1001V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DEF-300真空干燥箱 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Science-IID細(xì)胞破碎儀 上海京工實(shí)業(yè)有限公司；SZ-97A自動(dòng)三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 制樣

將新鮮金佛手削皮切小片，平鋪于托盤(pán)中，于53 ℃溫度條件下置于烘箱中放24 h。取出后，磨粉過(guò)60 目篩備用。

1.3.2 金佛手總黃酮的提取工藝

精密稱(chēng)取金佛手粉1 g共9 份，按照一定料液比加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SDS溶液浸泡24 h。在微波爐中進(jìn)行提取，用真空泵抽提過(guò)濾，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。濾液轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液稀釋至刻度。

1.3.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解，在100 mL容量瓶中定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度0.500 0 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別取樣液和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液各10 mL于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇水溶液稀釋至約25 mL，加入1.4 mL亞硝酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）搖勻，靜置6 min；然后加入1.4 mL硝酸鋁（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），搖勻，靜置6 min；最后加入10 mL氫氧化鈉（1 mol/L），然后補(bǔ)加50%乙醇溶液至刻度，靜置10 min。以50%乙醇溶液為空白參比，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上掃描300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的圖譜（圖1）。金佛手樣品液在250～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收峰，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液在280～300 nm和320 nm左右波長(zhǎng)處有吸收峰。黃酮類(lèi)化合物具有羰基與兩芳香環(huán)形成的共軛體系，在紫外區(qū)產(chǎn)生特征吸收。故對(duì)提取樣品液選擇在吸收波長(zhǎng)300 nm條件下定量測(cè)定。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（A）和金佛手樣液（B）的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of quercetin standard and flavonoids extracted from fingered citron

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立

分別取0、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中，按照1.3.4節(jié)的方法，以試劑做空白參比，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)300 nm波長(zhǎng)處吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 金佛手總黃酮提取量測(cè)定

分別取待測(cè)提取液各10 mL，按1.3.4節(jié)方法測(cè)定提取液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及式（1）計(jì)算金佛手總黃酮提取量。

1.3.7 金佛手總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

1.3.7.1 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

精密稱(chēng)取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W、微波時(shí)間50 s，過(guò)濾、定容，測(cè)定總黃酮提取量。

1.3.7.2 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

精密稱(chēng)取金佛手粉1 g五份，以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W、微波時(shí)間50 s，過(guò)濾、定容，測(cè)定總黃酮提取量。

1.3.7.3 微波功率對(duì)總黃酮提取量的影響

精密稱(chēng)取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率分別為10、30、50、80、100 W，微波時(shí)間50 s，過(guò)濾、定容，測(cè)定總黃酮提取量。

1.3.7.4 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

精密稱(chēng)取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W，微波時(shí)間分別為10、30、50、70、90 s，過(guò)濾、定容，測(cè)定總黃酮提取量。

1.3.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時(shí)間4 個(gè)因素，按照正交試驗(yàn)四因素三水平設(shè)計(jì)（表1），以金佛手中總黃酮提取量為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.9 金佛手總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.3.9.1 金佛手總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

佛手總黃酮清除自由基能力通過(guò)佛手黃酮與DPPH作用進(jìn)行測(cè)定[20-21]。參照羅麗萍[22]的方法：準(zhǔn)確配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液和質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 mg/L的金佛手黃酮溶液。比色管中準(zhǔn)確量入2 mL DPPH溶液和2 mL金佛手黃酮溶液，25 ℃水浴中放置30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。金佛手黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率可用式（2）計(jì)算：

式中：Ai為2 mL金佛手黃酮溶液+2 mL DPPH溶液吸光度；Aj為2 mL金佛手黃酮溶液+2 mL 95%乙醇溶液吸光度；Ac為2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇溶液吸光度。

1.3.9.2 金佛手總黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性測(cè)定采用ABTS方法[23]。具體步驟為：ABTS溶解在水中，最終濃度為7 mmol/L，加入適量的二氧化錳以產(chǎn)生ABTS自由基，含有ABTS自由基的溶液可在室溫下避光保存12 h以上，然后用針頭過(guò)濾器過(guò)濾，室溫下避光再保存6 h。ABTS自由基可在室溫下避光保存2 d以上。測(cè)定黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性之前，先用乙醇稀釋ABTS自由基使之吸光度為0.70±0.02（25 ℃，734 nm波長(zhǎng)處）。測(cè)試時(shí)，取1 mL稀釋ABTS自由基溶液加入到10 μL溶解在乙醇中的黃酮類(lèi)化合物溶液中，2 min后記下吸光度。金佛手黃酮對(duì)ABTS自由基的清除率可用式（3）計(jì)算。

式中：Ai為10 μL金佛手黃酮溶液+1 mL ABTS溶液吸光度；Aj為10 μL金佛手黃酮溶液+1 mL 95%乙醇溶液吸光度；Ac為1 mL ABTS溶液+10 μL 95%乙醇溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

在0～0.20 mg/mL范圍內(nèi)，槲皮素質(zhì)量濃度與吸光度之間具有良好線性關(guān)系，線性相關(guān)性為0.999 8，線性回歸方程y=6.106 2x-0.010 3，其中x表示槲皮素質(zhì)量濃度，y表示300 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2.2 金佛手總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金佛手總黃酮提取量的影響

圖2 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of SDS concentration on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖2可知，隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，金佛手總黃酮提取量逐漸增加，在SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.6%～0.8%時(shí)提取量達(dá)到最大值（平行測(cè)樣3 次），隨后，總黃酮提取量隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而略有降低。其原因可能是隨著表面活性劑增加，溶液中膠束數(shù)量也在增加，從而增強(qiáng)了溶解能力，因此導(dǎo)致總黃酮提取量增加較快。由于金佛手中黃酮含量有限，因此當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，則總黃酮提取量沒(méi)有增加?？紤]到經(jīng)濟(jì)性，選取SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%進(jìn)行總黃酮的提取。

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖3可知，最佳料液比是1∶20（g/mL）?？傸S酮提取量隨著液體含量的增加出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，但當(dāng)料液比在1∶20之后時(shí)，提取量開(kāi)始下降?？赡芤?yàn)榻鸱鹗挚傸S酮中還存在棕櫚酸等水溶性物質(zhì)，若是溶液含水過(guò)少，則原料與溶液接觸面不夠，進(jìn)而影響這部分黃酮類(lèi)化合物的溶解及浸出。當(dāng)液體含量過(guò)高時(shí)，溶劑吸收的能量增加，減少了金佛手原料對(duì)于能量的吸收而導(dǎo)致產(chǎn)率偏低，并且過(guò)多的溶劑會(huì)在后續(xù)的濃縮步驟中消耗過(guò)多的能量，因此選擇料液比1∶20進(jìn)行黃酮的提取。

2.2.3 微波功率對(duì)總黃酮提取量的影響

圖4 微波功率對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，微波功率為30 W時(shí)的總黃酮提取量達(dá)到最大值。當(dāng)微波功率大于30 W，提取量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。其原因可能是隨著微波功率的升高，原材料破壁速度加快，黃酮溶出增加。但由于本研究使用的是普通微波爐，當(dāng)微波功率增大時(shí)，一方面會(huì)有部分原料液損失，另一方面則是由于溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致部分黃酮類(lèi)化合物分解或者結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致總黃酮提取量降低。

2.2.4 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖5可知，最佳微波時(shí)間是50 s。微波時(shí)間越長(zhǎng)，理論總黃酮提取量應(yīng)該越多，但是隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，提取容器中溫度的急劇上升也可能導(dǎo)致部分黃酮類(lèi)化合物的損失。

圖5 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of microwave irradiation time on the extraction yield of total flavonoids

2.3 正交試驗(yàn)

L9（34）正交試驗(yàn)得到不同條件下佛手中總黃酮提取量及極差分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

結(jié)果表明，4 種因素對(duì)金佛手總黃酮提取量的影響次序依次為：料液比（B）＞微波功率（D）＞SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）＞微波時(shí)間（C）。最佳工藝條件為：B3D1A1C2，即在SDS溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波爐中以30 W功率提取50 s的條件下，重復(fù)提取3 次，得到金佛手中總黃酮平均提取量為18.706 0 mg/g。

2.4 金佛手總黃酮抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 金佛手總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH常用來(lái)篩選自由基清除劑以及評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性[24]。金佛手黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖6所示。隨著金佛手黃酮及槲皮素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除率也在增加，在質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，清除率分別為79.15%和86.80%（有顯著性差異）。因此，金佛手黃酮對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力，清除效果略弱于槲皮素。

圖6 金佛手總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids from fingered citron

2.4.2 金佛手總黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

生物樣品的總抗氧化能力通常用其對(duì)ABTS自由基的清除能力來(lái)表示。反應(yīng)中，ABTS首先經(jīng)過(guò)氧化生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS水溶性自由基，待測(cè)物的加入可以使ABTS水溶性自由基的顏色減弱，其734 nm波長(zhǎng)處的特征吸光度降低，根據(jù)吸光度的降低可以判斷待測(cè)物的總抗氧化能力[25]。金佛手總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力如圖7所示。槲皮素和金佛手黃酮對(duì)ABTS自由基均有較強(qiáng)清除能力，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，在質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，清除率分別為68.50%和65.25%（有顯著性差異）。由此可見(jiàn)，金佛手黃酮對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)清除能力，清除效果略低于槲皮素。

圖7 金佛手總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of total flavonoids from fingered citron

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，表面活性劑輔助微波提取金佛手中總黃酮的最佳工藝條件為SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波功率30 W、微波時(shí)間50 s，在此條件下，金佛手中總黃酮提取量為18.706 0 mg/g，略低于已有研究[17]。分析可能是因?yàn)楸狙芯恐惺褂玫氖瞧胀ㄎ⒉t，無(wú)法對(duì)提取液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間加熱，導(dǎo)致在提取過(guò)程中，提取液有所損失，總黃酮并無(wú)完全溶出；微波技術(shù)和超聲波技術(shù)的工作原理不同，也是導(dǎo)致SDS輔助微波提取金佛手中總黃酮得率較低的原因。對(duì)SDS輔助微波提取得到的金佛手總黃酮進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金佛手黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，其抗氧化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Microwave Extraction Assisted with the Surfactant Sodium Dodecyl Sulphate and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Fingered Citron (Citrus medica var. sarcodactylis)

ZHAO Li-li1, CAI Lu-xi2, YE Jing-xiong2, FENG Jie2, ZHAO Yu-ling2,*
(1. Zhejiang Zhongding Detect Technology Co. Ltd., Yiwu 322000, China; 2. College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

In the present study, the impacts of SDS concentration, material-to-liquid ratio, microwave power, and irradiation time on the extraction of total flavonoids from the fruits of fingered citron (Citrus medica var. sarcodactylis) were explored by single factor and orthogonal array designs. Results indicated that the optimal extraction conditions were determined as follows: SDS concentration, 0.6%; material-to-liquid ratio, 1:20 (g/mL); microwave power, 50 W; and irradiation time, 30 s. The yield of total flavonoids under the optimized conditions was 18.706 0 mg/g. The total flavonoids scavenged 79.15% of DPPH radical and 65.25% of ABTS radical, showing a slightly weaker radical scavenging activity than quercetin. Therefore, the total flavonoids from fingered citron have potent antioxidant activity and can be used as antioxidants in the food and medicine fields.

total flavonoids from fingered citron; SDS; microwave extraction; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）18-0047-05

10.7506/spkx1002-6630-201418009

2014-01-03

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Q12C050001）；金華市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012-3-073）；浙江師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（ZC304009077）；浙江師范大學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（72）

趙麗麗（1983—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)樯瘷z測(cè)。E-mail：zlili0307@163.com

*通信作者：趙玉玲（1977—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樯餆o(wú)機(jī)化學(xué)。E-mail：yulingzhao@zjnu.cn