韓勝男，李 妍，張曉杭，蔣建蘭*

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

花椒揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及抗腫瘤活性分析

韓勝男，李 妍，張曉杭，蔣建蘭*

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

采用水蒸氣蒸餾法提取花椒中的揮發(fā)油，以得油率為評價指標(biāo)，以料液比、冷浸時間和提取時間為考察因素，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選花椒揮發(fā)油提取工藝。結(jié)果表明：花椒揮發(fā)油水蒸氣蒸餾提取的最佳工藝條件為料液比1∶12（g/mL）、冷浸時間2.5 h、提取時間4.7 h，得油率可達(dá)9.284%。采用MTT法檢測花椒揮發(fā)油的體外抗腫瘤活性，測得花椒揮發(fā)油對HeLa、A549、K562 三種細(xì)胞的IC50值分別為（11.2±0.2）、（6.26±0.05）、（1.37±0.03） mg/mL。表明花椒揮發(fā)油具有較強的體外抗腫瘤活性，且對3種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用。

花椒；揮發(fā)油；水蒸氣蒸餾提取；抗腫瘤

花椒，又稱秦椒、川椒或山椒，為蕓香科花椒屬植物青椒（青花椒）（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）或花椒（紅花椒）（Zanthoxylum bungeaum Maxim.）的干燥成熟果皮[1]，原產(chǎn)于我國，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用食物?；ń肪哂歇毺貪饬蚁銡猓且环N重要的調(diào)味品，也可作為香料香精原料[2]；同時，花椒性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有溫中散寒、除濕、殺蟲、止痛等功效[3-5]?；ń分泻卸喾N化學(xué)成分，其主要成分為揮發(fā)油。現(xiàn)代研究表明花椒揮發(fā)油含有多種活性成分且具有抗菌、殺蟲等多種藥理活性[6-8]，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[9-10]。目前，花椒揮發(fā)油提取已有微波、超臨界等多種方法的研究報道[11-13]，關(guān)于花椒揮 發(fā)油的研究多集中于成分分析以及抗菌、殺蟲等藥理活性 研究[14-16]。臧林泉等[17]采用SRB方法對花椒揮發(fā)油進(jìn)行抗人A549肺癌殺傷及誘導(dǎo)凋亡試驗，結(jié)果表明高濃度花椒揮發(fā)油對其有殺傷作用，低濃度揮發(fā)油對其有誘導(dǎo)凋亡作用。Paik等[18]研究發(fā)現(xiàn)花椒揮發(fā)油可通過促進(jìn)活性氧含量殺傷人HepG2肝癌細(xì)胞。盡管，近年來研究表明花椒揮發(fā)油具有抗腫瘤活性[17-18]，但報道尚少。本研究采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行花椒揮發(fā)油提取，操作簡單方便，節(jié)約成本，制 得揮發(fā)油雜質(zhì)含量少，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，提高揮發(fā)油得油率，同時采用MTT法檢查揮發(fā)油對人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞和人紅白血病K562細(xì)胞3 種不同細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，為花椒揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒購于安國市新東方藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)地陜西，剔除枝葉和花椒籽，50 ℃烘干1 h，粉碎過40目篩，備用。

Na2SO4（分析純） 天津江天化工技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素 美國生命技術(shù)公司；胎牛血清 北京鼎國生藥技術(shù)有限責(zé)任公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；依托泊苷（批號：09090731） 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、K562細(xì)胞均由武警醫(yī)學(xué)院生藥與藥劑學(xué)教研室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

JD100-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；NAPCO5420-1型CO2培養(yǎng)箱 美國Napco公司；JJT-900/1300型超凈工作臺 北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；Model 680型酶標(biāo)儀 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)公司；Olympus1×70倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Adventurer萬分之一電子天平 美國Ohaus公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒揮發(fā)油提取工藝

準(zhǔn)確稱取花椒粉末100 g，冷水浸泡一定時間后，轉(zhuǎn)移至2 000 mL圓底燒瓶，加一定量水用揮發(fā)油提取器提取一定時間。收集精油部分，緩慢加入適量Na2SO4干燥，除去Na2SO4，得揮發(fā)油稱質(zhì)量，按式（1）計算得油率[19]：

1.3.2 最佳提取工藝優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料[20-22]及預(yù)實驗，選取影響提取工藝的主要因素料液比（A）、冷浸時間（B）、提取時間（C）作為考察因素，以花椒揮發(fā)油得油率為響應(yīng)值，進(jìn)行星點設(shè)計-響應(yīng)面法。因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.3 花椒揮發(fā)油體外抗腫瘤活性測定

1.3.3.1 樣品制備及細(xì)胞培養(yǎng)

取最佳提取工藝條件下制備的花椒揮發(fā)油適量，加入DMSO溶解，用RPMI1640無血清培養(yǎng)液稀釋成250、25、2.5、0.25、0.025 mg/mL；HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、K562細(xì)胞細(xì)胞株分別培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī) 培養(yǎng)。

1.3.3.2 MTT法檢測抗腫瘤活性

采用MTT法，檢測花椒揮發(fā)油分別對人宮頸癌HeLa細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞3 種癌細(xì)胞的生長抑制作用[23]。取對數(shù)生長期的各細(xì)胞分別接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個/mL，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后給藥。藥物處理組每孔加入不同質(zhì)量濃度的花椒揮發(fā)油溶液100 μL，使終質(zhì)量濃度分別為125、1 2.5、1.25、0.125、0.0125 mg/mL，另設(shè)陽性對照組（加入不同濃度的依托泊苷100 μL）、陰性對照組（加入溶劑100 μL）和空白對照組（加入培養(yǎng)基100 μL）。每組均設(shè)4 個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液每孔加入MTT溶液（1 mg/mL）50 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，離心棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕度振蕩10 min。酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔光密度（optical density，OD）值，計算藥物對細(xì)胞的生長抑制率，計算公式為：

樣品平行制備2 份，每份樣品重復(fù)實驗3 次。依據(jù)待測藥物不同劑量下的細(xì)胞抑制率，用GraphPad軟件計算藥物半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

2.1.1 數(shù)學(xué)回歸模型的建立及方差分析

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到花椒揮

發(fā)油得油率與料液比、冷浸時間、提取時間3 個因素之間的編碼值回歸模型：得油率Y=8.871+0.139A+0.349B+ 0.605C+0.117AB-0.304AC+0.045 8BC-0.518A2-0.382B2-0.433C2。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results for the fitted regression model

對擬合的方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P=0.010 5＜0.05，表明回歸模型顯著；失擬項P=0.260 6＞0.05，差異不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾小，殘差均由隨機誤差引起；回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.800 2，說明模型擬合程度良好。因素C、交互項AC及二次項A2對花椒揮發(fā)油得油率有顯著影響（P＜0.05），其余項不顯著，表明各因素對揮發(fā)油得油率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.1.2 工藝條件優(yōu)化及預(yù)測

圖1 料液比、冷浸時間和提取時間對揮發(fā)油得油率的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots showing the effects of solid to liquid ratio, soaking time and extraction time on the yield of essential oil

根據(jù)回歸模型方程，將料液比（A）、冷浸 時間（B）、提取時間（C）對花椒揮發(fā)油得油率的影響繪制成響應(yīng)面圖（圖1）。由圖1可知，提取時間對揮發(fā)油得油率影響最顯著，表現(xiàn)為曲線最陡，料液比次之，冷浸時間的影響最小。根據(jù)回歸方程及響應(yīng)面，得到最佳提取條件：料液比1∶11.95（g/mL）、冷浸時間2.5 h、提取時間4.74 h。考慮到實際操作的方便性，將最佳提取條件修正為料液比1∶12（g/mL）、冷浸時間2.5 h、提取時間4.7 h。在此條件下，平行提取花椒揮發(fā)油3 次，得到的實際得油率為9.284%，與理論預(yù)測值9.178%接近，說明該回歸方程能較真實地反映各因素對花椒揮發(fā)油得油率的影響，可用于花椒揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化。

2.2 花椒揮發(fā)油體外抗腫瘤活性

花椒揮發(fā)油對HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞和K562細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用?；ń窊]發(fā)油及陽性對照組對各細(xì)胞的IC50值計算結(jié)果見表4。本實驗采用依托泊苷為陽性對照組，依托泊苷是常用的抗腫瘤藥物，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于癌癥的化療方案。由表4可知，花椒揮發(fā)油對K562細(xì)胞生長抑制作用較強，對HeLa細(xì)胞生長抑制作用相對較弱。與陽性對照組對比可知，花椒揮發(fā)油對A549細(xì)胞和K562細(xì)胞的IC50值偏小、對HeLa細(xì)胞的IC50值偏大，表明其對A549細(xì)胞和K562細(xì)胞的抑制作用略優(yōu)于陽性對照藥物，對HeLa細(xì)胞的抑制作用則偏差?？傮w說明，花椒揮發(fā)油具有良好的抗腫瘤作用，且對多種不同腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。

表4 花椒揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞的IC50值Table 4 IC50of the essential oil for three cancer cell lines

表4 花椒揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞的IC50值Table 4 IC50of the essential oil for three cancer cell lines

細(xì)胞系花椒揮發(fā)油IC50/（mg/mL）陽性對照組IC50/（mg/mL）HeLa11.2±0.24.39±0.03 A5496.26±0.059.02±0.05 K5621.37±0.034.79±0.06

3 結(jié) 論

影響花椒揮發(fā)油提取的因素主要有料液比、冷浸時間、提取時間，通過采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對花椒揮發(fā)

油水蒸氣提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了花椒揮發(fā)油得油率與料液比、冷浸時間、提取時間之間關(guān)系的二次多項式回歸方程，該模型準(zhǔn)確有效，確定了提取花椒揮發(fā)油的最佳工藝條件，即料液比1∶12（g/mL）、冷浸時間2.5 h、提取時間4.7 h，得油率可達(dá)9.284%。在體外抗腫瘤活性實驗中，采用MTT法檢測了花椒揮發(fā)油對HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞和K562細(xì)胞的生長抑制活性，結(jié)果表明花椒揮發(fā)油對這3 種腫瘤細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用，通過與陽性對照藥物進(jìn)行對比，表明花椒揮發(fā)油具有良好的體外抗腫瘤作用。本研究為花椒的深入開發(fā)利用提供了參考，其抗腫瘤活性成分及作用機制還需進(jìn)一步探討。

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Extraction and Antitumor Activity of Essential Oil from Zanthoxylum bungeanum Seeds

HAN Sheng-nan, LI Yan, ZHANG Xiao-hang, JIANG Jian-lan*
(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Response surface methodology was used to optimiz e the steam distillation extraction of essential oil from Zanthoxylum bungeanum seeds. The yield of essential oil was investigated with respect to solid-to-solvent ratio, cold water soaking time and extraction time. The optimum extraction conditions were determined as follows: solid-to-solvent ratio 1:12 (g/mL), cold water soaking time 2.5 h and extraction time 4.7 h, leading to an extraction yield of 9.284%. MTT assay was used to detect the antitumor activity of the essential oil. Its 50% inhibition concentration (IC50) for HeLa, A549 and K562 cells were (11.2±0.2), (6.26±0.05) and (1.37±0.03) mg/mL, respectively, suggesting potent antitumor activity in vitro and inhibitory effect on various cancer cells.

Zanthoxylum bungeanum; essential oil; steam distillation; antitumor activity

R284

A

1002-6630（2014）18-0013-04

10.7506/spkx1002-6630-201418003

2013-12-17

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81102900）

韓勝男（1989—），女，碩士，研究方向為中藥現(xiàn)代化工程。E-mail：lingnanshengxue@163.com

*通信作者：蔣建蘭（1972—），女，副教授，博士，研究方向為中藥現(xiàn)代化工程。E-mail：jljiang@tju.edu.cn