鄭惠玲，鄧寶浣,*，肖桂秋，鐘新林

（1.量子高科（中國）生物股份有限公司，廣東 江門 529081；2.賽默飛世爾科技應(yīng)用研究中心廣州實驗室，廣東 廣州 510070）

高效離子交換色譜法測定半乳糖、葡萄糖、乳糖及低聚半乳糖含量

鄭惠玲1，鄧寶浣1,*，肖桂秋1，鐘新林2

（1.量子高科（中國）生物股份有限公司，廣東 江門 529081；2.賽默飛世爾科技應(yīng)用研究中心廣州實驗室，廣東 廣州 510070）

建立離子色譜法定量測定以乳糖為原料、使用β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的低聚半乳糖產(chǎn)品的方法。樣品前處理過程中用體積稀釋法代替質(zhì)量稀釋法，采用高效CarboPac PA20陰離子交換色譜柱和積分安培法檢測，并對淋洗液組成進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的方法加標(biāo)回收率90.58%～99.45%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.54%。半乳糖、葡萄糖、乳糖的方法檢出限分別為0.24、0.59、0.75 ?g/g。半乳糖和葡萄糖在0.2～7 ?g/mL、乳糖在0.6～10 ?g/mL的范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 2～0.999 9之間。用此方法測定6種原料低聚半乳糖，目標(biāo)組分總含量為95.84%～101.19%。

高效離子交換色譜；低聚半乳糖；積分安培

低聚半乳糖產(chǎn)品作為新資源食品[1]被廣泛應(yīng)用在嬰幼兒食品、乳制品、飲料、烘烤食品、糖果中[2-3]。低聚半乳糖成分組成復(fù)雜，是具有不同聚合度或同一聚合度但含有多個不同糖苷鍵異構(gòu)體的寡糖混合物[4]。低聚半乳糖的主鏈以半乳糖為構(gòu)成單元，鏈端常以單個葡萄糖結(jié)尾，單糖之間的β-糖苷鍵的連接方式以1→4半乳糖為主，此外還包括1→2半乳糖、1→3半乳糖、1→2葡萄糖、1→3葡萄糖、1→4葡萄糖、1→6葡萄糖等連接方式[5-6]。由于目前還無法制備所有組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品，不能進(jìn)行低聚半乳糖各組分（包括半乳低聚二糖到半乳低聚八糖）的外標(biāo)法檢測。國內(nèi)外的檢測方法主要有薄層色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-11]、離子色譜法[12-13]。而高效液相色譜-示差檢測法較為普遍使用[9]，但液相色譜柱的分離效果不夠理想、示差檢測器靈敏度較低。離子色譜作為液相色譜的一種，由于其優(yōu)異的分離能力及配有高靈敏度的脈沖安培檢測器，在糖的檢測中得到越來越多的應(yīng)用[14-18]。AOAC.2001.02[19]中推薦的離子交換色譜法是一種在國際上得到廣泛應(yīng)用的測定食品中低聚半乳糖含量的方法，但測定原料中低聚半乳糖含量的標(biāo)準(zhǔn)化方法未見報道。

本研究在AOAC.2001.02方法和前人研究的基礎(chǔ)上，通過色譜柱選擇、色譜條件優(yōu)化、前處理方法優(yōu)化，建立符合低聚半乳糖的質(zhì)量檢測要求[1]、能準(zhǔn)確測定低聚半乳糖中葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖含量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；氫氧化鈉 美國Dionex公司；醋酸鈉（色譜純）、無水葡萄糖、半乳糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、β-半乳糖苷酶（Aspergillus oryzae） 美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（分析純） 西隴化工股份有限公司；99.9%氮氣 金珠江氣體有限公司；低聚半乳糖、低聚果糖產(chǎn)品（QHT） 量子高科（中國）生物股份有限公司；低聚半乳糖產(chǎn)品（Domo） 荷蘭Borculo Domo Ingredients公司；0.22 μm尼龍濾膜 天津市富集科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000離子色譜儀（配有四元梯度泵、脈沖安培檢測器、脫氣裝置、GM-3淋洗液混合器、柱溫箱、AS-DV自動進(jìn)樣器、Chromeleon 6.8色譜工作站） 美國Dionex公司；FA2104型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；Casada BIO超純水機 美國Pall公司；SHA-B型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；TG1650-WS型離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；pHS-3C型pH計 上?？祪x儀器有限公司；高效液相色譜儀（配有等度泵、示差檢測器、柱溫箱） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）：稱取22.0 g磷酸二氫鉀和6.0 g三水磷酸氫二鉀，溶于水中，稀釋至1 L，120 ℃高壓滅菌器中滅菌30 min，備用。

2 000 U/mL酶混懸液：取適量活性為8.9 U/mg的半乳糖苷酶，加入磷酸緩沖溶液配制成2 000 U/mL的溶液。酶混懸液制備后需在8 h內(nèi)使用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取100 mg（精確至0.000 1 g）半乳糖、無水葡萄糖、105.3 mg乳糖（乳糖一水合物質(zhì)量×0.95=無水乳糖）于100 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000 ?g/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用前根據(jù)需要，用超純水稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)樣。

1.3.2 樣品前處理

稱取0.1～0.2 g（精確至0.000 1 g）低聚半乳糖試樣（按干基計），用80 ℃ 80 mL磷酸鹽緩沖溶液溶解，然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容，配制成1.0～2.0 mg/mL的測試樣液。

樣液A：取100 mL的容量瓶標(biāo)號為A，吸取10 mL測試樣液加水定容至100 mL混勻，溶液過0.22 μm濾膜過濾后稀釋Di倍后進(jìn)離子色譜儀測定低聚半乳糖中游離的半乳糖、葡萄糖、乳糖含量。

滅活樣液B：在100 mL容量瓶中加入1 mL酶混懸液和1 mL磷酸緩沖液，置于100℃水浴加熱10 min，使酶失活，放至室溫后加入10 mL測試樣液；酶解樣液C：在100 mL容量瓶中加入10 mL測試樣液后再加入1 mL酶混懸液和1 mL磷酸緩沖液；然后將B和C容量瓶用錫箔紙密閉并搖勻，于（60±2）℃水浴恒溫振蕩器振蕩30 min（避免產(chǎn)生泡沫），取出后冰浴冷卻至室溫。B、C分別加入20 mL 20%（V/V）乙腈，用水定容至100 mL，混勻。分別取適量于離心管中，10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，濾液分別稀釋D1、D2倍后測定。1.3.3 色譜條件[13,19-20]

根據(jù)目標(biāo)組分半乳糖和葡萄糖、乳糖與低聚半乳糖組分的分離效果，測定不同色譜柱、不同氫氧化鈉和醋酸鈉濃度（5～25 mmol/L）以得到分離度較好、分析時間較短的淋洗液洗脫梯度程序。

色譜柱：CarboPac PA20保護柱（3 mm×30 mm），CarboPac PA20分離柱（3 mm×150 mm，6.5 μm）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量25 ?L；檢測方式：Au電極，AgCl參比模式，脈沖安培檢測，糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形；淋洗液洗脫梯度程序表1。

表 1 洗脫梯度程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 方法檢出限的測定

稱取16.0 mg半乳糖、13.3 mg葡萄糖、43.2 mg乳糖加水至100 g，混合均勻，分別稱取7個混合液10 g，按1.3.2節(jié)中B處理方法處理后稀釋5倍，進(jìn)行離子色譜儀測定。能夠被檢出且在被分析物濃度大于零時能以99%置信度報告的最低濃度定為本方法的檢出限[21]。方法檢出限（method detection limit，MDL）按式（1）計算：

式中：ν1、ν2為自由度；t（ν1＋ν2，1-α）為自由度為ν1＋ν2時的Student’s t值（可查表得到），1-α為置信水平；Spooled為合成標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 方法回收率的測定

根據(jù)《中華人民共和國藥典》[22]附錄中關(guān)于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，每100 mg低聚半乳糖漿（干基）中添加約14 mg乳糖。采用1.3.2節(jié)的B處理方法處理后稀釋5倍，進(jìn)行測定。按式（2）計算回收率：式中：A為供試品中被測成分的質(zhì)量/mg；B為加入對照品質(zhì)量/mg；C為實測值/mg。

1.3.6 低聚半乳糖中葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖含量計算按式（3）計算樣品A中游離半乳糖、葡萄糖或乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)xi（干基）：

式中：Ai為A中最終的半乳糖、葡萄糖或乳糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Di為樣液A的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量（液體為稱取樣品中可溶性固形物的質(zhì)量，固體為稱取樣品質(zhì)量減去水分質(zhì)量，下同）/g。

根據(jù)離子色譜分析結(jié)果，按下式計算初始樣液B中游離的半乳糖含量、乳糖含量、乳糖釋放的半乳糖含量以及水解產(chǎn)物C中總半乳糖含量，最終計算出低聚半乳糖的含量[6]。

按式（4）計算樣品B中游離半乳糖乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1（干基）：

式中；A1為滅活樣液B中最終的半乳糖乳糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；D1為滅活樣液B的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

按式（5）計算滅活樣液B中游離乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w2（干基）：

式中：A2為滅活樣液B中最終的乳糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；D1為滅活樣液B的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

按式（6）計算滅活樣液B中游離乳糖水解釋放的半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w3（干基）：

按式（7）計算酶解樣液C中總半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w4（干基）：

式中：A3為酶解樣液C中最終的半乳糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；D2為酶解樣液C的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

按式（8）計算酶解樣C中低聚半乳糖水解釋放半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w5（干基）：

按式（9）計算試樣中低聚半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w6（干基）：

式中：k為半乳糖轉(zhuǎn)化為反式低聚半乳糖的經(jīng)驗換算系數(shù)，可由式（10）計算：

式中：n為低聚半乳糖分子中半乳糖部分的平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

通過對比發(fā)現(xiàn)，PA20的穩(wěn)定性、分離效果都比PA1要好。因此選擇容量較低、靈敏度高、可實現(xiàn)樣品快速分離的CarboPac PA20柱進(jìn)行測定。

圖1 樣液（A）、滅活樣液（B）、酶解樣液（C）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of diluted sample (A), inactivated solution (B) and enzymatic hydrolysate (C)

在淋洗液NaOH濃度為10 mmol/L時，半乳糖和葡萄糖的分離度達(dá)1.8，同時也保證了乳糖與低聚半乳糖組分的分離。與AOAC法[19]相比，該方法的半乳糖、葡萄糖、乳糖的分離度有所提高，分析時間縮短了10 min，淋洗液的消耗量減少一半。樣品檢測色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理優(yōu)化

AOAC 2001.02的樣品前處理方法采用質(zhì)量法，記錄數(shù)據(jù)多，數(shù)據(jù)整理繁瑣，而選擇按體積進(jìn)行稀釋可減少數(shù)據(jù)記錄、簡化操作，使得結(jié)果計算更簡便。以乳糖為目標(biāo)組分，對同一糖漿使用質(zhì)量稀釋法和體積稀釋法的5次平行檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.86%，2種方法之間無顯著性差異，該前處理方法用于實際樣品測定具有良好的重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確性。2.3 方法檢出限和線性范圍

表 2 糖漿中乳糖的檢測結(jié)果（n =5）Table 2 Deter mination results of lactose in syrup (n = 5)

查表得置信水平為99%，自由度為6時的t值為3.143，得出半乳糖、葡萄糖、半乳糖的方法檢測限分別為0.24、0.59、0.75 ?g/g。

表 3 重復(fù)測定結(jié)果Table 3 Results of replicate determinations

配制不同質(zhì)量濃度（0.1～15 ?g/mL）的混合工作標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測試，得出半乳糖和葡萄糖質(zhì)量濃度在0.2～7 ?g/mL、乳糖質(zhì)量濃度在0.6～10 ?g/mL的范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系，3種糖的相關(guān)系數(shù)保持在0.999 2～0.999 9之間。

2.4 方法回收率

目前市場上缺乏低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，因而無法進(jìn)行直接添加低聚半乳糖標(biāo)品的回收率實驗，而乳糖是樣品中含有的、也是本方法的目標(biāo)組分，因此使用乳糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率實驗。共5個平行實驗，結(jié)果見表4，回收率為90.58%～99.45%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.54%，表明此法的準(zhǔn)確度較高。

表 4 乳糖回收率測定結(jié)果（ n=5）Table 4 Recovery rates of lactose (n = 5)

2.5 實際低聚半乳糖樣品檢測

不同菌種來源的β-半乳糖苷酶通過不同工藝生產(chǎn)出的低聚半乳糖產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)比例上存在一定的差異[18]，使得不同低聚半乳糖產(chǎn)品的平均聚合度不同，而影響換算系數(shù)k值的大小。使用平均聚合度（n＋1）方法、利用高效液相色譜雙柱法[8]對低聚半乳糖含量在30%～60%的QHT的12個樣品分析檢測，低聚半乳糖分子中半乳糖部分平均數(shù)為2.16，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%，得低聚半乳糖產(chǎn)品的經(jīng)驗換算系數(shù)k為1.36；而Domo漿狀樣品的k值為1.35。

隨機抽取5個QHT的GOS-57L產(chǎn)品和1個Domo漿狀樣品，使用本法測定低聚半乳糖的含量，同時檢測了1個低聚半乳糖和低聚果糖復(fù)配的糖漿樣品（自制），低聚半乳糖含量為48.62%（理論值為50.19%），見表5。檢測結(jié)果表明本方法既適用于測定以乳糖為原料、使用β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的低聚半乳糖產(chǎn)品，也適用于含低聚半乳糖復(fù)合糖的檢測。

表 5 6個低聚半乳糖樣品的組分檢測結(jié)果（ n=6）Table 5 Composition of 6 GOS samples ( n= 6)

3 結(jié) 論

本研究選擇靈敏度高的CarboPac PA20色譜柱建立快速準(zhǔn)確檢測樣品中半乳糖、葡萄糖、乳糖含量及低聚半乳糖含量的方法。與AOAC 2001.02方法相比，該方法簡化了樣品處理過程，降低了檢測成本，縮短了分析時間，提高了方法的靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確性。與高效液相色譜法相比，該法保證了半乳糖、葡萄糖、乳糖的分離，能準(zhǔn)確測定半乳糖的變化量，從而測定低聚半乳糖的含量。該方法不僅適用于以乳糖為原料、使用β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的低聚半乳糖產(chǎn)品的檢測，也適用于含低聚半乳糖復(fù)合糖的檢測。

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Determination of Galactose, Glucose, Lactose and Galacto-Oligosaccharide by High Performance Ion Exchange Chromatography

ZHENG Hui-ling1, DENG Bao-huan1,*, XIAO Gui-qiu1, ZHONG Xin-lin2
(1. Quantum Hi-Tech Biological Co. Ltd., Jiangmen 529081, China; 2. Guangzhou Laboratory of Application and Research Centre, Thermofisher Scientific, Guangzhou 510070, China)

A method was established to determine galacto-oligosaccharide (GOS), synthesized with β-galactosidase using lactose as the precursor, by ion exchange chromatography. The pre-treatment of samples was achieved through volume dilution instead of gravimetric dilution. CarboPac PA20 anion exchange column and pulsed amperometric detector were used to determine the contents of GOS. The recovery of the proposed method was 90.58%–99.45% and the relative standard deviation was 3.54%. The detection limits for gluctose, galactose and lactose were 0.24, 0.59 and 0.75 ?g/g, respectively. The method presented linear correlation coefficients between 0.999 2 and 0.999 9 when the concentrations of gluctose and galactose were in the range of 0.2–7.0 ?g/mL and lactose was 0.6–10 ?g/mL. Six GOS samples were determined by this method to contain galactose, glucose, lactose and GOS in the range of 95.84%–101.19%.

high performance ion exchange chromatography; galacto-oligosaccharide (GOS); pulsed amperometric detector

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0180-05

10.7506/spkx1002-6630-201406039

2013-05-30

鄭惠玲（1986—），女，助理工程師，研究方向為低聚糖分析及生產(chǎn)技術(shù)。E-mail：zhenghl@qht.cc

*通信作者：鄧寶浣（1986—），女，助理工程師，研究方向為檢測與分析。E-mail：dengbh@qht.cc