顏成英，湯曉艷*，王 敏，康大成，李朋穎，鄭 鋅

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測(cè)方法的建立

顏成英1,2，湯曉艷2,*，王 敏2，康大成2，李朋穎2，鄭 鋅1,2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

將熒光染料疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide，EMA）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，用于腸炎沙門氏菌活菌的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)EMA終質(zhì)量濃度50 μg/mL、曝光時(shí)間10 min時(shí)，可以抑制約107CFU/mL腸炎沙門氏菌死菌DNA的擴(kuò)增；活菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，EMA-PCR方法檢測(cè)限與單一PCR方法一樣均為27.5 CFU/mL，說明EMA處理既不會(huì)影響活菌DNA的擴(kuò)增也不會(huì)影響PCR方法的靈敏度。利用EMA-PCR方法檢測(cè)死活混合菌液時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加EMA的實(shí)驗(yàn)組DNA條帶亮度會(huì)隨著活菌比例的降低而變暗，且當(dāng)樣品中全是死菌時(shí)，沒有目標(biāo)條帶出現(xiàn)；而不添加EMA的對(duì)照組DNA條帶亮度沒有變化，當(dāng)樣品中全是死菌時(shí)，目標(biāo)條帶依然清晰可見。說明添加EMA可以達(dá)到區(qū)分死活菌的目的，EMA-PCR方法只檢測(cè)樣品中的活菌，避免了死菌DNA造成假陽性的可能性。

疊氮溴乙錠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；腸炎沙門氏菌

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）是引起人類腸胃炎的重要致病菌，也是導(dǎo)致禽蛋及其相關(guān)產(chǎn)品污染的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由腸炎沙門氏菌引起的食物中毒占沙門氏菌食物中毒總數(shù)的17%[2]，從患者身上分離出腸炎沙門氏菌血清型的頻率僅次于鼠傷寒沙門氏菌[3]。傳統(tǒng)分離純化法是腸炎沙門氏菌檢測(cè)常用方法，該方法雖然準(zhǔn)確率高，但過程繁瑣、耗時(shí)耗力[4-5]，不能滿足快速檢測(cè)的要求。隨著分子生物學(xué)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，多種快速檢測(cè)方法[6-7]應(yīng)運(yùn)而生并發(fā)展成熟，其中針對(duì) 各類致病菌特異性基因建立的PCR方法，因靈敏度高、速度快而被廣泛用于目標(biāo)菌的檢測(cè)[8-10]。但是單一PCR檢測(cè)技術(shù)無法區(qū)分樣品中的死菌和活菌[11]，因?yàn)樗劳鼍w的DNA會(huì)長(zhǎng)時(shí)間殘留在環(huán)境中[12]，PCR在以活菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)也會(huì)擴(kuò)增死菌的DNA，而使得檢測(cè)值高于樣品中活菌的數(shù)量，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)熒光染料疊氮溴乙錠（ethidium monoazide，EMA）可以特異性結(jié)合游離DNA、死菌DNA和細(xì)胞膜不完整或受損細(xì)胞的DNA，使其不能發(fā)生PCR反應(yīng)[13]，將EMA與PCR技術(shù)聯(lián)用可以達(dá)到克服傳統(tǒng)PCR無法區(qū)分死活菌缺點(diǎn)的目的。EMA-PCR方法已用于多種致病菌的檢測(cè)[14-15]，其中EMA濃度[16]及曝光時(shí)間[17]是影響死菌DNA擴(kuò)增抑制效果的關(guān)鍵因素，因?yàn)镋MA濃度過低、曝光時(shí)間過短均達(dá)不到完全抑制的目的，濃度過高又會(huì)對(duì)活菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)生影響[18]。本實(shí)驗(yàn)以腸炎沙門氏菌為研究對(duì)象，優(yōu)化抑制腸炎 沙門氏菌死菌DNA擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度和最佳曝光時(shí)間，分析EMA-PCR方法的靈敏度及驗(yàn)證EMA區(qū)分腸炎沙門氏菌死菌和活菌的效果，以期為將該方法應(yīng)用于腸炎沙門氏菌檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸炎沙門氏菌 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；EMA美國(guó)Sigma公司；2×Power Taq PCR Master Mix 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；DL 2000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

DEC-810 PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技公司；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；NanoDrop 2000C紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；鹵鎢燈（500 W） 飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 腸炎沙門氏菌活菌和死菌的制備

腸炎沙門氏菌接種LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，12 000 r/min離心10 min收集菌體，沉淀用滅菌生理鹽水懸浮，紫外-可見分光光度計(jì)調(diào)整OD600nm為0.40（菌液濃度為107CFU/mL），得到活菌菌懸液?；罹鷳乙?5 ℃水浴加熱30 min得到死菌菌懸液。平板培養(yǎng)活菌菌懸液及死菌菌懸液，分別用于菌落計(jì)數(shù)和滅活效果檢驗(yàn)。

1.2.2 抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度

取0.5 mL滅活菌懸液至離心管中，加入EMA至終質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100、200 μg/mL，37 ℃黑暗處放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管12 cm處曝光5 min，離心收集菌體，試劑盒法提取DNA，DNA提取物定容為500 μL。

1.2.3 抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴(kuò)增的最佳曝光時(shí)間

取0.5 mL滅活菌懸液至離心管中，加入EMA至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，37 ℃黑暗處 放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管12 cm處曝光，曝光時(shí)間分別為2、5、10、20 min，DNA提取同上。

1.2.4 EMA-PCR方法檢測(cè)靈敏度分析

滅菌生理鹽水梯度稀釋OD600nm為0.40的活菌菌懸液，使菌液濃度為107～101CFU/mL，每個(gè)稀釋度取0.5 mL，各取兩管，一管加入EMA（終質(zhì)量濃度為50 μg/mL、曝光10 min）處理后再提取DNA，一管不做處理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.5 不同活菌比例的混合菌液的EMA-PCR擴(kuò)增

分別配制含有100%、75%、50%、20%、10%、5%、3%、1%、0%的腸炎沙門氏菌活細(xì)胞的菌懸液，分別取0.5 mL至離心管中，各取兩管，一管加入EMA（終質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL、曝光10 min）處理后再提取DNA，一管不做處理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.6 引物序列及PCR反應(yīng)

引物序列為沙門氏菌屬通用引物[19]，引物序列上游：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGG GCAA-3’，下游：5’-TCATCGCACCGTCAAA GGAACC-3’，產(chǎn)物大小為284 bp，引物由上海生工合成。25 μL的擴(kuò)增體系包括：12.5 μL PCR Master Mix，1.5 μL模板DNA，上下游引物各1.5 μL（8 μmol/L）、8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制死菌DNA擴(kuò)增的EMA質(zhì)量濃度的確定

圖1 腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測(cè)方法中EMA質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of EMA concentration

活菌菌懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果為2.75×107CFU/mL，死菌菌懸液培養(yǎng)平板無菌落長(zhǎng)出，說明滅活較徹底。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示，目標(biāo)條帶大小為284 bp。當(dāng)菌液濃度為2.75×107CFU/mL時(shí)，DNA條帶亮度隨著EMA質(zhì)量濃度的增大逐漸變暗直至消失，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)即可完全抑制107CFU/mL死菌的DNA擴(kuò)增。

2.2 最佳曝光時(shí)間的確定

不同曝光時(shí)間對(duì)EMA抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。當(dāng)菌液濃度為2.75×107CFU/mL時(shí)，DNA條帶亮度隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變暗直至消失，曝光時(shí)間為5 min時(shí)，條帶基本消失，為了達(dá)到完全抑制目的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)曝光時(shí)間設(shè)為10 min。

圖2 不同曝光時(shí)間抑制死菌DNA擴(kuò)增Fig.2 Optimization of exposure time

2.3 EMA-PCR方法對(duì)腸炎沙門氏菌活菌檢測(cè)靈敏度分析

圖3 EMA對(duì)腸炎沙門氏菌活菌的影響Fig.3 Effect of EMA on viable salmonella enteritis cells

EMA質(zhì)量濃度為50 μg/mL、曝光時(shí)間為10 min時(shí)，EMA-PCR方法對(duì)腸炎沙門氏菌活菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。EMA實(shí)驗(yàn)組（圖3A）隨著菌液濃度的降低，DNA條帶亮度逐漸變暗，當(dāng)稀釋度為10-6即菌液濃度為27.5 CFU/mL時(shí)，依然有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，所以其靈敏度檢測(cè)最低限為27.5 CFU/mL。此外，對(duì)比EMA實(shí)驗(yàn)組（圖3A）與對(duì)照組（圖3B），當(dāng)菌液濃度相同時(shí)，兩組 DNA條帶亮度基本一致，說明EMA處理不會(huì)影響腸炎沙門氏菌活菌DNA的擴(kuò)增。

2.4 不同活菌比例混合菌液的EMA-PCR擴(kuò)增

如圖4所示，不添加EMA的對(duì)照組雖然活菌比例不同，但是死菌和活菌的總量是一樣的，所以DNA條帶的亮度是一致，即使活菌比例是0%時(shí)依然有目標(biāo)條帶出現(xiàn)；而添加EMA的實(shí)驗(yàn)組，因?yàn)镋MA會(huì)與死菌的DNA結(jié)合使其不能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所以參與擴(kuò)增反應(yīng)的初始模板的量是不一樣的，故條帶的亮度是不同的，且當(dāng)活菌比例是0%時(shí)沒有目標(biāo)條帶出現(xiàn)。

圖4 EMA-PCR對(duì)腸炎沙門氏菌混合菌液的檢測(cè)Fig.4 Detection of mixed bacteria by EMA-PCR

3 討 論

EMA與PCR聯(lián)用的方法已用于多種目標(biāo)菌的檢測(cè)[20-21]，但是不同種屬死菌DNA擴(kuò)增被完全抑制所需EMA的濃度是不同的，EMA滲透到不同種屬的活菌細(xì)胞的能力也是不一樣的[22]，可能是由不同種屬菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性或滲透性不同所造成的[23]。Lee等[16]發(fā)現(xiàn)，若曝光時(shí)間定為10 min時(shí)，0.8 μg/mL的EMA即可抑制濃度為5×107CFU/mL的腐敗菌死菌的DNA擴(kuò)增，質(zhì)量濃度為10 μg/mL的EMA對(duì)活菌的DNA擴(kuò)增沒有影響，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL則會(huì)顯著影響活菌的DNA擴(kuò)增；倫鏡盛等[24]研究表明，曝光時(shí)間為10 min時(shí)，2 μg/mL的EMA能有效的抑制1×108CFU/mL副溶血弧菌死菌PCR反應(yīng)，EMA質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)對(duì)活菌靶基因的擴(kuò)增沒有明顯抑制，當(dāng)質(zhì)量濃度高于10 μg/mL時(shí)，PCR反應(yīng)被顯著性抑制。Nocker等[23]利用SYTO9/EMA對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，EMA會(huì)將大腸桿菌O15∶H7等活菌細(xì)胞染成紅色，且50 μmol/mL EMA處理鏈球菌、微球菌、金黃色葡萄球菌活菌時(shí)會(huì)導(dǎo)致DNA提取量損失60%甚至更多，但是50 μmol/mL EMA不會(huì)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌及黏質(zhì)沙雷氏菌的DNA提取量造成損失。趙瑜等[25]研究發(fā)現(xiàn)，EMA質(zhì)量濃度為從0 μg/mL增加到18 μg/mL時(shí)，樣品PCR條帶亮度無明顯減弱，表明低于18 μg/mL的EMA不會(huì)抑制沙門氏菌活菌的擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)曝光時(shí)間為5 min時(shí)，50 μg/mL的EMA即能達(dá)到抑制2.75×107CFU/mL腸炎沙門氏菌死菌DNA擴(kuò)增的目的，且對(duì)活菌沒有影響。

另外，曝光時(shí)間也是影響EMA抑制死菌PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素。Helen等[26]使用EMA RT-PCR方法檢測(cè)果汁中的結(jié)合酵母，曝光時(shí)間從1 min延長(zhǎng)至5 min時(shí)，EMA抑制5×107CFU/mL死菌DNA擴(kuò)增的Ct值從29.7±0.179增加到37.9±1.817；Shi Hui等[27]證明曝光時(shí)間延長(zhǎng)至20 min時(shí)ΔCt值會(huì)明顯大于曝光時(shí)間為5、10、15 min時(shí)的ΔCt值，而Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，曝光時(shí)間為1 min時(shí)，目標(biāo)條帶即消失。本實(shí)驗(yàn)中，曝光時(shí)間為5 min時(shí)，目標(biāo)條帶不再出現(xiàn)，但是為了實(shí)驗(yàn)更加準(zhǔn)確，將曝光時(shí)間定為10 min。

建立的EMA-PCR方法的靈敏度分析結(jié)果顯示，該方法的靈敏度與單一PCR方法相同，且用該方法檢測(cè)不同活菌比例的混合菌液時(shí)，目標(biāo)DNA條帶亮度會(huì)隨著活菌所占比例的降低逐漸變暗，當(dāng)活菌比例為0%時(shí)，沒有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，說明EMA-PCR方法在不影響檢測(cè)靈敏度的基礎(chǔ)上，可以克服死菌造成假陽性的缺點(diǎn)，為將該方法用于實(shí)際樣品檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。但是普通PCR無法對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，后續(xù)研究可以將EMA與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，達(dá)到準(zhǔn)確定量活菌數(shù)量的目的。

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Detection of Viable Cells of Salmonella enteritidis by EMA-PCR

YAN Cheng-ying1,2, TANG Xiao-yan2,*, WANG Min2, KANG Da-cheng2, LI Peng-ying2, ZHENG Xin1,2
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

The combination of ethidium monoazide (EMA) and PCR was used for detecting viable cells of Salmonella enteritis. The optimization of experimental parameters showed that a final EMA concentration of 50 μg/mL and exposure time of 10 min could restrain DNA amplification of dead bacteria in 107CFU/mL of Salmonella enteritis. EMA-PCR and direct PCR methods showed the same detection limit of 27.5 CFU/mL for viable cells, suggesting that neither DNA amplification from viable cells nor PCR sensitivity is affected by the addition of EMA. As we observed for mixtures of viable and dead cells by the EMA-PCR method, the brightness of DNA stripes turned darker with reducing the proportion of viable cells, and when all bacteria were dead, no target stripe appeared. As for the control group without added EMA, the brightness of DNA stripe had no change, and even though the bacteria were all dead, the target stripe remained distinct. Therefore, the EMA-PCR method can distinguish dead bacteria from live ones, thereby avoiding false positive detection.

ethidium monoazide bromide (EMA); polymerase chain reaction (PCR); Salmonella enteritidis

TS251.7

A

1002-6630（2014）06-0090-04

10.7506/spkx1002-6630-201406018

2013-10-08

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B03）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31000799）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-42）

顏成英（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：15116998250@163.com

*通信作者：湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量與安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)。E-mail：txycaas@126.com