劉 晶 王美艷 范世華

(東北大學(xué) 理學(xué)院 分析科學(xué)研究中心，沈陽 110004)

0 前言

亞硫酸鹽通常指二氧化硫及能夠產(chǎn)生二氧化硫的無機性亞硫酸鹽，在食品加工中廣泛用作漂白劑、防腐劑和抗氧化劑；二氧化硫是葡萄酒釀造過程中不可缺少的添加劑，其主要功能是防腐殺菌、澄清、抗氧化和增酸、增色、改善果酒風(fēng)味等[1]，但過量使用亞硫酸鹽類食品添加劑會破壞食品的營養(yǎng)素。人類若食用過量的亞硫酸鹽會產(chǎn)生頭痛、惡心、暈眩、氣喘、蕁麻疹等過敏反應(yīng)[2]。目前亞硫酸鹽的安全性問題已引起越來越多的關(guān)注。

SO32-定量測定方法有高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、離子色譜法[5]、熒光光譜分析法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]、分光光度分析法[8]等。在我國測定二氧化硫常用的方法是鹽酸副玫瑰苯胺-甲醛比色法。但鹽酸副玫瑰苯胺-甲醛比色法手工操作繁瑣、空白背景大、重現(xiàn)性差，所使用的試劑四氯汞鉀和甲醛等毒性較強，易對環(huán)境造成新的污染；同時該方法對鹽酸的加入量要求十分苛刻，因此在應(yīng)用上受到一定限制。而順序注射法與分光光度分析法聯(lián)用技術(shù)在無機離子及有機物測定方面得到了很好的應(yīng)用[9-10]。本文基于孔雀綠與二氧化硫的褪色反應(yīng)，將順序注射進樣氣體擴散分離與光度分析法聯(lián)用，快速、準(zhǔn)確地測定了葡萄酒中SO2的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SIS-4100四道順序注射系統(tǒng)(北京吉天儀器公司)：由注射泵、8位選擇閥和5 mL針筒組成，注射器和多位閥的操作由計算機控制；722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)；氣體擴散膜(自行加工)；PCL-711B數(shù)據(jù)采集卡(Advantech CO.，臺灣)。

無水亞硫酸鈉(CP)、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸(36%～38%)，購自沈陽市試劑廠；孔雀石綠(BS)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉和碳酸氫鈉購自上海虹光化工廠。上述試劑除另有說明，皆為分析純，水為二次去離子水。

EDTA鈉鹽溶液(0.001 mol/L)、磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(0.025 mol/L)、孔雀綠儲備溶液(4×10-3mol/L)、二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 000 mg/L)。

孔雀綠工作溶液：準(zhǔn)確移取10 mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(0.125 mol/L)于50 mL容量瓶中，加入適量水稀釋后，再加入一定體積的孔雀綠標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，稀釋后定容至刻度，搖勻，配制成適當(dāng)濃度的孔雀綠工作溶液。

1.2 實驗方法

按照圖1所示的實驗流路，SI系統(tǒng)通過八位選擇閥的一個閥位通道對整個流路用水進行沖洗后，將含有孔雀綠指示劑的溶液吸入儲存管并反向推至氣體擴散膜的接收液流通道；然后沖洗儲存管路后再依次將試樣、試劑順序地吸入儲存管，并反向?qū)⑵渫迫虢o予液流通道進行化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的氣態(tài)二氧化硫經(jīng)PTFE膜擴散進入給予液流通道，最后將給予液流中的指示劑溶液推入流通池，在波長615 nm處實時記錄吸光度信號。測定試劑空白的吸光度A0和顯色反應(yīng)后溶液的吸光度A，并計算吸光度差值A(chǔ)0-A。全部操作過程在計算機控制下按一定程序完成。

圖1 氣體擴散-順序注射分光光度法測定流路圖Figure 1 Schematic diagram of SIA system with gas diffusion for spectrophotometric determination.C—載流；VSP—兩位閥；SP—注射泵；MPV—八位選擇閥；D—檢測器；W—廢液；HC—儲存管(i.d. 0.8 mm，管長200 cm)；RC—反應(yīng)管(i.d. 0.8 mm，管長30 cm)；R1—HCl溶液；R2—孔雀綠溶液；S—試樣溶液

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長的選擇

反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜見圖2。在350～750 nm的范圍內(nèi)，顯色產(chǎn)物在615 nm處的吸光度最大，實驗選定615 nm 為檢測波長。

圖2 吸收光譜曲線Figure 2 Absorption spectra.

2.2 檢測流速的選擇

實驗采用氣體擴散分離裝置在順序注射進樣條件下將待測組分與基體分離，因此需要優(yōu)化試樣與鹽酸混合反應(yīng)后流經(jīng)給予液流通道的速度即給予液流速V1和吸收了擴散SO2的孔雀綠指示劑溶液進入檢測器的速度即接收液流速V2。

給予液流速V1對吸光度差值的影響如圖3。給予液流通道是試樣與試劑反應(yīng)生成SO2的通道，流速V1越小，試劑與試樣在管路中的留存時間及反應(yīng)時間就越長，所生成的SO2越多，通過氣體擴散分離器后轉(zhuǎn)化為SO32-的量越大，與指示劑進行加成反應(yīng)的程度也就越大，指示劑褪色也就越明顯。在實驗中兼顧靈敏度及取樣頻率，選擇其流速V1為1.2 mL/min。

圖3 給予液流速V1對吸光度差值的影響 Figure 3 Effect of V1 flow rate on relative absorbance.

接收液流速V2對吸光度差值的影響如圖4。由圖可知，吸光度差值隨系統(tǒng)流速V2的增加而明顯降低。這是因為在實驗中，接收液流通道中的孔雀綠指示劑在弱堿性條件下，與經(jīng)擴散進入通道的SO2轉(zhuǎn)化為SO32-后發(fā)生加成反應(yīng)，使孔雀綠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其褪色。由于加成反應(yīng)的反應(yīng)速率較為緩慢，若流速V2過快，減少了反應(yīng)時間，會使SO32-無法充分與指示劑發(fā)生加成反應(yīng)，降低反應(yīng)進行的程度，進而導(dǎo)致吸光度差值較小。流速V2為1.2 mL/min時，可以獲得相對高的靈敏度和較大的取樣頻率，因此實驗中選擇1.2 mL/min作為最佳的系統(tǒng)流速V2值。

圖4 給予液流速V2對吸光度差值的影響 Figure 4 Effect of V2 flow rate on relative absorbance.

2.3 試樣體積的選擇

實驗觀察到，隨著試樣體積的增加，吸光度總值增加。這是因為隨著與鹽酸發(fā)生反應(yīng)的試樣增多，產(chǎn)生的SO2也增多，因此吸光度差值迅速增大；試樣體積增大到200 μL以后趨于平緩，這是由于在管路中進行的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在試樣與試劑相互滲透的界面上，當(dāng)樣品體積增大到200 μL時，過多的試樣溶液在管路中無法與鹽酸進一步接觸滲透，所以產(chǎn)生的SO2量沒有明顯增多，因此吸光度差值增加較緩慢。兼顧靈敏度和分析速度，實驗選擇200 μL作為試樣的最佳進樣體積。

圖5 試樣體積對吸光度差值的影響Figure 5 Effect of sample volume on relative absorbance.

2.4 鹽酸溶液和孔雀綠溶液體積的選擇

實驗結(jié)果表明，吸光度差值隨鹽酸體積的增加而逐漸增加，但增加幅度不是很明顯。實驗確定選擇100 μL作為鹽酸的最佳體積，孔雀綠溶液的體積對吸光度差值的影響如圖6所示。孔雀綠溶液為本實驗的指示劑，其體積的增加，可以減少兩端載流對擴散膜處的指示劑區(qū)帶的稀釋，從而保證給予液流區(qū)帶中央部位(與位于擴散單元中給予液流相對應(yīng)部位)能有較高濃度的孔雀綠與擴散過來的SO2發(fā)生反應(yīng)，以增加靈敏度并獲得較好的重現(xiàn)性。當(dāng)孔雀綠體積在100～200 μL范圍內(nèi)變化時，吸光度差值隨孔雀綠體積的增加而逐漸增大；當(dāng)體積達(dá)到200 μL并繼續(xù)增大時，吸光度差值基本不再變化，因此選擇200 μL作為孔雀綠溶液的最佳體積。

圖6 孔雀綠體積對吸光度差值的影響 Figure 6 Effect of MG volume on relative absorbance.

2.5 鹽酸濃度的選擇

實驗結(jié)果表明，系統(tǒng)中所使用的鹽酸濃度不同會直接影響吸光度差值的大小。隨著鹽酸濃度的增加，吸光度差值也隨之增加；當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mol/L時吸光度差值達(dá)到最大；繼續(xù)增加鹽酸濃度，吸光度差值則緩慢降低，如圖7所示。實驗選擇0.5 mol/L作為HCl的最佳工作濃度。

圖7 HCl濃度對吸光度差值的影響 Figure 7 Effect of HCl concentration on relative absorbance.

2.6 孔雀綠溶液濃度的選擇

試樣中產(chǎn)生的SO2透過氣體擴散膜進入到孔雀綠溶液中，在堿性條件下SO2轉(zhuǎn)化為SO32-后，與孔雀綠發(fā)生加成反應(yīng)使其褪色，因此孔雀綠溶液的濃度直接影響空白溶液的吸光度值及加成反應(yīng)的褪色程度。如圖8所示，吸光度差值隨孔雀綠濃度的增大而顯著增大，但濃度太高會導(dǎo)致吸光度超過儀器的線性響應(yīng)范圍。為保證其空白吸光度控制在光度計的線性響應(yīng)范圍內(nèi)并獲得較高的靈敏度，選擇2.0×10-4mol/L作為孔雀綠的最佳濃度，此時空白信號的吸光度約為1.40。

圖8 孔雀綠濃度對吸光度差值的影響 Figure 8 Effect of MG concentration on relative absorbance.

2.7 共存組分的干擾

在氣體擴散分離過程中，氣體擴散膜將大部分的非揮發(fā)性基體組分隔離在給予液流通道的一側(cè)，消除了其對指示劑褪色反應(yīng)的干擾，然而在基體組分中仍可能存在酸性條件下轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氣體組分(如二氧化碳等)，同樣也可以透過擴散膜進入到接收液中，對測定產(chǎn)生干擾。本實驗對HCO3-，CO32-的干擾情況進行了考察。

在上述優(yōu)化的最佳實驗條件下，以20 μg/mL的SO32-標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測試溶液，在相對誤差±5%的允許范圍內(nèi)，NaHCO3，Na2CO3的允許倍數(shù)分別為150和20倍。

2.8 方法的分析性能

在選定的實驗參數(shù)下，當(dāng)接收液流速V2為1.2 mL/min時，在1.0～5.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，吸光度差值與二氧化硫濃度呈線性響應(yīng)關(guān)系。線性回歸方程為：ΔA=0.031 4c+0.004 4(r=0.999 4，n=6)，其中c為二氧化硫濃度，ΔA為吸光度差值。以空白溶液吸光度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為方法的檢出限(3σ)，計算得檢出限為0.33 μg/mL。

當(dāng)接收液流速V2為4.2 mL/min時，在5.0～50.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，吸光度差值與二氧化硫濃度呈線性響應(yīng)關(guān)系。線性回歸方程為：ΔA=0.007 7c+0.0327(r=0.997 8，n=7)。連續(xù)11次重復(fù)一定濃度的樣品溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.29%～0.43%，精密度良好。

為了驗證方法的準(zhǔn)確性，對兩種葡萄酒樣品進行加標(biāo)回收率考察。按實驗中的操作方法，在兩種葡萄酒的進樣量均為200 μL的條件下，分別測定其吸光度差值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中SO2的濃度。測定結(jié)果及加標(biāo)回收率見表1。

表1實際樣品加標(biāo)回收率

Table1Resultsofrecoverytest/(mg·L-1)

由表1可知，兩種葡萄酒樣品的加標(biāo)回收率在98.7%～104.7%(n=3)。

3 結(jié)語

實驗首次提出單泵單閥式順序注射進樣體系與氣體擴散分離裝置聯(lián)用，基于在微堿性條件下，亞硫酸根離子可與孔雀綠溶液發(fā)生加成反應(yīng)并使其褪色的原理，測定了葡萄酒中二氧化硫的含量。流路簡單，所使用的指示劑毒性小，不附著管路、易于沖洗，用于葡萄酒中二氧化硫的測定，取得比較滿意的結(jié)果。

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