曾艷藝，賴子尼，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜

廣東魴幼魚對(duì)銅、鎘脅迫的氧化應(yīng)激響應(yīng)及其指示意義

曾艷藝，賴子尼*，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，珠江水域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部珠江中下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州，510380

廣東魴（Megalobrama terminalis）是具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珠江流域特有魚類，已列入國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)品種。近年來(lái)，隨著河流固有生境持續(xù)破壞，重金屬等水體污染問(wèn)題不斷加劇，以廣東魴為代表的當(dāng)?shù)靥赜恤~類資源急劇下降。文章以銅、鎘暴露對(duì)廣東魴幼魚48 h的半致死濃度值LC50暴露濃度強(qiáng)度為1個(gè)毒性單位（TU）為基準(zhǔn)，以室內(nèi)靜水實(shí)驗(yàn)法研究了銅、鎘離子在低效應(yīng)濃度、中效應(yīng)濃度、高效應(yīng)濃度（分別對(duì)應(yīng)于0.01 TU、0.03 TU和0.11 TU）脅迫對(duì)廣東魴幼魚的氧化應(yīng)激效應(yīng)，以期找出適宜的生物標(biāo)記物，完善珠江水域污染評(píng)價(jià)與預(yù)警體系。結(jié)果顯示，廣東魴幼魚MDA、GSH、T-AOC、SOD和CAT（以Pr計(jì)）隨暴露濃度及暴露時(shí)間發(fā)生變化，其范圍分別在1.08～7.34 nmol·mg-1、0.42～22.82 mg·g-1、0.10～1.32 U·mg-1、2.45～13.24 U·mg-1和0.01～0.09 U·mg-1之間。其中，GSH、MDA和T-AOC在銅、鎘暴露后第1天迅速響應(yīng)至高值，相應(yīng)的各濃度處理組明顯高于對(duì)照組。曲線回歸結(jié)果顯示，GSH與暴露濃度c（以TU量計(jì)）之間呈顯著的二次曲線關(guān)系，擬合方程為GSH=-2112(c-0.084)2+18.1，r=0.847，n=10，P=0.012，暴露濃度閾值為0.084 TU。SOD和CAT則在暴露后第4天響應(yīng)至高值。曲線回歸結(jié)果顯示，SOD與c及CAT與c之間均呈顯著的二次曲線關(guān)系，擬合方程分別為SOD=-2073(c-0.059)2+14.3，r=0.840，n=10，P=0.014；CAT=-21.2(c-0.056)2+0.102，r=0.877，n=10，P=0.006，相應(yīng)的暴露濃度閾值分別為0.059 TU和0.056 TU。與暴露濃度呈顯著的二次曲線關(guān)系的各指標(biāo)中，GSH響應(yīng)最為迅速，SOD和CAT的響應(yīng)最為靈敏，加之SOD與CAT相關(guān)性極強(qiáng)，表明GSH、SOD和CAT這3種氧化應(yīng)激指標(biāo)可作為珠江流域水體污染的潛在生物標(biāo)記物。

廣東魴；重金屬；氧化應(yīng)激；毒性單位；生物標(biāo)記物

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

廣東魴生活在水體中下層，喜棲息于江河底質(zhì)多淤泥或石礫的緩流處；以水生植物及軟體動(dòng)物為食。自然種群的成魚在每年的3─4月間產(chǎn)卵，仔、幼魚以浮游生物為食，人工養(yǎng)殖幼魚可以人工飼料等為食。本次實(shí)驗(yàn)廣東魴幼魚購(gòu)自廣州市吉鯧水產(chǎn)魚苗繁殖基地，以曝氣2 d以上的自來(lái)水在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)以供實(shí)驗(yàn)。魚苗平均體長(zhǎng)2.5±0.2 cm，體重0.35±0.07 g。在室內(nèi)自然光照下暫養(yǎng)，水體pH7.6～7.8，水溫26～28 ℃，硬度126～138 mg(CaCO3)·L-1，溶解氧7.20～7.85 mg·L-1。暫養(yǎng)條件下魚苗自然死亡率＜2%，實(shí)驗(yàn)前1 d停止喂食。

1.2試劑藥品

藥品CuSO4·5H2O、CdCl2·2.5H2O和NaCl2均為分析純。先分別以去離子水配制濃度為1 g·L-1（均為離子質(zhì)量濃度，下同）的銅、鎘貯備液濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)以預(yù)先經(jīng)過(guò)曝氣48 h的自來(lái)水配成所需的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3毒性單位確定及實(shí)驗(yàn)設(shè)置

以48 h致半數(shù)廣東魴死亡的暴露濃度(48 h LC50)為1個(gè)毒性單位，金屬暴露濃度以計(jì)量單位TU表示。根據(jù)等毒性法設(shè)置低、中、高3個(gè)濃度效應(yīng)組的銅、鎘單一亞急性毒性及聯(lián)合毒性脅迫廣東魴幼魚實(shí)驗(yàn)，其中聯(lián)合毒性以1∶1毒性單位配比法設(shè)置。預(yù)先對(duì)該批廣東魴幼魚進(jìn)行單一銅、鎘48 h急性毒性實(shí)驗(yàn)，得出銅的48 h LC50及其95%置信區(qū)間為0.8（0.6～1.0）mg·L-1，鎘的48 h LC50及其95%置信區(qū)間為1.4（1.2～1.7）mg·L-1。依據(jù)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）中相應(yīng)濃度限值（銅為0.01 mg·L-1；鎘為0.005 mg·L-1），該標(biāo)準(zhǔn)是基于多種水生標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物毒性結(jié)果制定的安全濃度值，理論上其毒性單位為1% LC50，可認(rèn)為這兩個(gè)濃度值對(duì)廣東魴的毒性單位數(shù)相等，為0.01 TU，故由此確定低銅、鎘濃度組；中、高暴露濃度組則根據(jù)銅、鎘單獨(dú)暴露對(duì)廣東魴48 h LC50的1/30和1/9設(shè)置，銅、鎘的聯(lián)合脅迫組以銅、鎘各貢獻(xiàn)一半毒性單位數(shù)的配比方式分別設(shè)置低、中、高效應(yīng)濃度值，故低、中、高暴露濃度分別為0.01 TU、0.03 TU和0.11 TU，各組濃度的配制如表1所示。

表1 廣東魴幼魚暴露濃度（TU）設(shè)置及實(shí)驗(yàn)始末銅、鎘質(zhì)量濃度Table 1 The nominal toxic concentrations (TU) and the determined concentrations of Cu and Cd at the initial and the end of toxic experiment on juvenile M. terminalis mg·L-1

1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程

由于魚樣品氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定可能受檢測(cè)過(guò)程中的處理溫度和指標(biāo)分析時(shí)限影響較大，因此在實(shí)驗(yàn)中分預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的是為了確定樣品的組內(nèi)個(gè)體差異值范圍，分別在玻璃缸中僅以所設(shè)的3個(gè)中濃度組，實(shí)驗(yàn)組2、5和8（見(jiàn)表1）配制體積為20 L的水體，每個(gè)濃度的缸

里放入30尾實(shí)驗(yàn)魚，靜置實(shí)驗(yàn)。分別在實(shí)驗(yàn)第1、4和7天從每個(gè)缸里取5尾魚，每尾魚分別進(jìn)行蛋白質(zhì)（protein，Pr）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量等氧化應(yīng)激指標(biāo)分析。結(jié)果確定了每組樣品所測(cè)指標(biāo)的個(gè)體之間的差異＜10%（n=5）。

正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，在水體體積為10 L的玻璃養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組放入10尾廣東魴幼魚，靜置實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間不投餌、不充氣，自然光照，水體理化指標(biāo)保持與暫養(yǎng)條件相同。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，分別在第1、4、7和14天分別從各處理組中取出2尾魚，用超純水沖洗后吸干，將樣品存放于-20 ℃超低溫冰箱，并在2 h內(nèi)勻漿，勻漿樣品4 ℃保存以待各氧化應(yīng)激指標(biāo)分析，其中，CAT、GSH和T-AOC在4 h內(nèi)分析完畢，SOD和MDA在6 h內(nèi)分析完畢。此外，在實(shí)驗(yàn)初始及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別從各處理組取上層水樣，以石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定其中銅、鎘濃度。根據(jù)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）規(guī)定的方法利用Agilent AA DUO原子吸收光譜儀測(cè)定。

1.5樣品的處理

全魚樣品去鰭后（每尾質(zhì)量約0.3 g）放入小燒杯，以質(zhì)量體積比約為1∶9的比例先加入0.86%冰冷生理鹽水2/3，用潔凈小剪迅速將魚體剪碎成小組織塊，將剪碎的組織與生理鹽水混合液倒入玻璃勻漿器，再加入余下的1/3生理鹽水潤(rùn)洗小燒杯將組織液全量轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，在冰上研磨5～8 min使組織勻漿化，制成10%左右的勻漿液。將制好的勻漿轉(zhuǎn)移至潔凈離心管，在4 ℃、3000 r·min-1離心10 min，棄沉淀留上清液保存在4 ℃，以待進(jìn)行以下各氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

Pr含量、T-AOC、SOD、CAT活性及GSH和MDA含量是利用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒，結(jié)合紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。其中，Pr測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，用小牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，每毫克蛋白在1 ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量，為1個(gè)SOD活力單位；采用H2O2分解法測(cè)CAT，每毫克蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的H2O2相對(duì)量，為一個(gè)CAT活力單位；T-AOC采用Fe3+還原法測(cè)定，37 ℃時(shí)，每分鐘每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)為一個(gè)T-AOC單位；采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH含量，以Pr計(jì)，單位為mg·g-1；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定丙二醛（MDA）含量，以Pr計(jì)，其單位為nmol·mg-1。各指標(biāo)的測(cè)定步驟參照南京建成生物公司的試劑盒說(shuō)明書。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用K-S檢驗(yàn)確定各變量利用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較不同暴露時(shí)間各響應(yīng)指標(biāo)之間的均值差異；經(jīng)K-S檢驗(yàn)確定各變量服從正態(tài)分布后，利用Excell軟件對(duì)銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應(yīng)激效應(yīng)進(jìn)行毒性單位與效應(yīng)關(guān)系分析并作圖；利用成對(duì)樣本t檢驗(yàn)法分析低、中和高濃度銅、鎘單一因子和聯(lián)合處理組對(duì)廣東魴幼魚的氧化應(yīng)激效應(yīng)差異；采用相關(guān)分析判別廣東魴幼魚各響應(yīng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。除特別注明外，統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS16.0 for Windows下進(jìn)行。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間廣東魴幼魚無(wú)死亡。實(shí)驗(yàn)初始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組中銅、鎘濃度如表1所示，期間銅、鎘濃度測(cè)定值與實(shí)驗(yàn)設(shè)定值誤差（＜20%），在允許范圍內(nèi)。

2.1銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應(yīng)激指標(biāo)隨暴露時(shí)間的變化

廣東魴幼魚各氧化應(yīng)激指標(biāo)隨實(shí)驗(yàn)暴露時(shí)間的變化如表2所示。正式實(shí)驗(yàn)期間所有處理組MDA含量（以Pr計(jì)，下同）在1.08～7.34 nmol·mg-1之間。暴露第1天后即達(dá)高值，顯著高于第4、7、14天（df=3，F(xiàn)=38.60，P＜0.001），且各處理組明顯高于對(duì)照組；其后，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，并保持相對(duì)恒定，且各處理組并未明顯高于對(duì)照組。意味著廣東魴受亞急性銅、鎘濃度暴露后，很快表現(xiàn)出氧化損傷，但隨著機(jī)體啟動(dòng)抗氧化防御系統(tǒng)后，氧化損傷程度有所下降。

GSH含量（以Pr計(jì)，下同）變化較大，在0.42～22.82 mg·g-1之間。其中暴露第1天后迅速至高值，顯著高于第4、7、14天（df=3，F(xiàn)=31.99，P＜0.001），各處理組亦明顯高于對(duì)照組，其后均隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，并保持相對(duì)恒定，且各處理組并未明顯高于對(duì)照組。這意味著廣東魴受亞急性銅、鎘濃度暴露后，隨著體內(nèi)氧化壓力的產(chǎn)生，機(jī)體首先啟動(dòng)以GSH為代表的第一道抗氧化防御防線來(lái)清除氧自由基，GSH含量迅速增加，但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)GSH消耗增加，GSH含量很快降低。

T-AOC是機(jī)體總抗氧化壓力的指標(biāo)，T-AOC活力（以Pr計(jì)，下同）在0.10～1.32 U·mg-1之間變化，亦是暴露第1天達(dá)高值，顯著高于第4、7、14

天（df=3，F(xiàn)=22.02，P＜0.001），且各處理組明顯高于對(duì)照組，隨后第4、7天逐漸下降，而在第14天又有所回升，但除第1天外，其余時(shí)間顯示各處理組并未明顯高于對(duì)照組。

SOD活性（以Pr計(jì)，下同）在2.45～13.24 U·mg-1之間變動(dòng)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性在第4天顯著高于其余時(shí)間（df=3，F(xiàn)=67.64，P＜0.001），且僅在第4天銅、鎘不同濃度暴露脅迫組與對(duì)照組的SOD水平差異較大，其它時(shí)間差異不明顯。

CAT活性（以Pr計(jì)，下同）變化范圍為0.01～0.09 U·mg-1，其與SOD活性變化趨勢(shì)相似，亦在第4天顯著高于其他時(shí)間（df=3，F(xiàn)=24.81，P＜0.001）。CAT活性亦是在第4天時(shí)不同銅、鎘濃度處理組明顯高于對(duì)照組，而在其他時(shí)間處理組與對(duì)照組的差異不明顯。

表2 廣東魴幼魚各氧化應(yīng)激指標(biāo)隨實(shí)驗(yàn)暴露時(shí)間的變化響應(yīng)統(tǒng)計(jì)描述Table 2 Statistic description of time-variation of response substances in juvenile M. terminalis to Cu2+, Cd2+exposure

2.2銅、鎘脅迫對(duì)廣東魴氧化應(yīng)激響應(yīng)的劑量—效應(yīng)關(guān)系

實(shí)驗(yàn)第1天時(shí)GSH、T-AOC和MDA達(dá)高值，且各處理組與對(duì)照組之間存在明顯的差異，故對(duì)銅、鎘脅迫下第1天的GSH、T-AOC和MDA響應(yīng)值與暴露濃度（以TU計(jì)）進(jìn)行劑量—效應(yīng)關(guān)系分析，曲線回歸分析結(jié)果如圖1所示。曲線關(guān)系式表示為y=A(c-B)2+C，其中y為各氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)，A為系數(shù)，c為暴露濃度（以TU計(jì)），B為相應(yīng)氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的暴露濃度，C為相應(yīng)氧化應(yīng)激指標(biāo)的最大值（下同）。廣東魴幼魚GSH與暴露濃度之間呈顯著（P＜0.05）的二次曲線關(guān)系（P=0.012），且在暴露濃度為0.084 TU時(shí)GSH含量最高，對(duì)應(yīng)于銅、鎘單一因子暴露的濃度分別為0.067、0.118 mg·L-1，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合暴露濃度為0.034 mg·L-1銅與0.059 mg·L-1鎘。盡管T-AOC和MDA與暴露濃度呈一定的二次曲線關(guān)系，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著（P＞0.05）。

圖1 銅、鎘暴露濃度與廣東魴幼魚GSH、T-AOC、MDA水平的劑量—效應(yīng)關(guān)系Fig. 1 The concentration-effect relationships between GSH , T-AOC, MDA levels in juvenile M. terminalis and Cu2+, Cd2+exposure concentrations

實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)SOD和CAT達(dá)到最大，且各處理組與對(duì)照組之間存在明顯的差異，從而對(duì)銅、鎘脅迫下第4天的SOD、CAT活性與銅、鎘暴露濃度（以TU計(jì)）進(jìn)行劑量—效應(yīng)回歸分析，結(jié)果如圖2所示。廣東魴幼魚SOD和CAT活性與暴露濃度呈顯著（P＜0.05）的二次曲線關(guān)系，P值分別為0.014和0.006；SOD在暴露濃度為0.059 TU時(shí)達(dá)到最大，對(duì)應(yīng)的銅、鎘單一因子暴露濃度分別為0.047和0.082 mg·L-1，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合暴露濃度為0.024 mg·L-1

銅與0.041 mg·L-1鎘。CAT在暴露濃度為0.056 TU時(shí)達(dá)到最大，對(duì)應(yīng)的銅、鎘單一因子暴露濃度分別為0.045和0.078 mg·L-1，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合暴露濃度為0.022 mg·L-1銅與0.039 mg·L-1鎘。

圖2 銅、鎘暴露濃度與廣東魴幼魚CAT、SOD活性的劑量—響應(yīng)關(guān)系Fig. 2 The concentration-effect relationships between CAT, SOD activities in juvenile M. terminalis and Cu2+, Cd2+exposure concentrations

2.3銅和鎘脅迫對(duì)廣東魴幼魚氧化應(yīng)激響應(yīng)的聯(lián)合效應(yīng)

進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)前，分別求銅、鎘單一因子低、中和高濃度毒性脅迫下的SOD、CAT活性、T-AOC及GSH和MDA均值（如低濃度組的SODa計(jì)算公式為：SODa=1/2(SOD1+SOD4)，其中1和4為實(shí)驗(yàn)組號(hào)，見(jiàn)表1），連同對(duì)應(yīng)的銅和鎘聯(lián)合處理組低、中、高濃度組各指標(biāo)（如低濃度組SODd=SOD7）進(jìn)行各單獨(dú)變量K-S檢驗(yàn)，各變量均服從正態(tài)分布（n=12，P＞0.05）。進(jìn)而對(duì)相應(yīng)的單一銅、鎘低、中、高濃度暴露組各指標(biāo)均值與聯(lián)合處理組各指標(biāo)實(shí)測(cè)值進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。盡管各變量在單一毒性均值與聯(lián)合毒性實(shí)測(cè)值雖有差異，但檢驗(yàn)的P值均大于0.05。意味著銅、鎘聯(lián)合脅迫與銅、鎘單獨(dú)作用效應(yīng)差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即銅、鎘對(duì)廣東魴幼魚的氧化毒性及抗氧化防御響應(yīng)可能是協(xié)同或弱協(xié)同作用，拮抗和增強(qiáng)作用均不顯著。

表3 銅、鎘單一因子和聯(lián)合毒性脅迫下廣東魴幼魚氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)成對(duì)樣本t檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of paired-sample T test on oxidative stress and responses of juvenile M.terminalis to single and combined exposure of Cu2+and Cd2+

2.4銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)之間的關(guān)系

由于各指標(biāo)值不完全服從正態(tài)分布，其兩兩間采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果如表4所示：廣東魴幼魚SOD與CAT活性呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，但SOD與其它3個(gè)指標(biāo)無(wú)顯著的相關(guān)性；MDA含量與T-AOC、GSH含量亦呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)T-AOC與GSH含量亦呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系；但CAT活性與MDA和GSH含量存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而其它指標(biāo)兩兩之間的線性關(guān)系不顯著。

表4 銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應(yīng)激指標(biāo)兩兩間的Spearman相關(guān)系數(shù)Table 4 Spearman correlation coefficients of MDA, GSH, SOD, CAT and T-AOC of juvenile M. terminalis to Cu2+, Cd2+exposure

3 討論

重金屬脅迫下，魚類往往會(huì)產(chǎn)生不同程度的氧化應(yīng)激響應(yīng)，這時(shí)機(jī)體活性氧自由基增多，超出自身清除能力，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，表現(xiàn)在其維生素C、維生素E、GSH等非酶抗氧化產(chǎn)物，SOD、CAT等抗氧化酶等被誘導(dǎo)或消耗（Martinez-Alvarez等，2005）。此時(shí)，機(jī)體往往伴隨著不同程度的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，MDA是機(jī)體內(nèi)ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映出機(jī)體氧化損傷的程度（Guel等，2004）。

現(xiàn)階段的研究表明，魚類氧化應(yīng)激響應(yīng)在魚的不同種類中呈現(xiàn)特定的時(shí)間變化趨勢(shì)（Srikanth等，

2013）。一般情況下，魚體率先利用維生素C、維生素E、GSH等小分子非酶抗氧化產(chǎn)物清除過(guò)多的ROS，構(gòu)成魚類抗氧化防御的第一道防線，當(dāng)這些非酶抗氧化產(chǎn)物不足以清除過(guò)多的ROS時(shí)，魚體則啟動(dòng)合成抗氧化酶以減少超負(fù)荷的氧化壓力，達(dá)動(dòng)態(tài)平衡（Martinez-Alvarez等，2005）。本研究中廣東魴幼魚暴露于亞急性銅、鎘后第1天，其GSH含量快速增加，MDA水平也快速增加，表明在亞急性銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚較快產(chǎn)生氧化壓力，而機(jī)體也快速啟動(dòng)第一道防線；此外，廣東魴幼魚的總抗氧化能力T-AOC也在第1天快速增加亦可作為廣東魴幼魚機(jī)體快速啟動(dòng)抗氧化防御的佐證。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，GSH的消耗量增大，因此廣東魴幼魚體內(nèi)的GSH水平迅速降低，相反SOD、CAT酶等活性增強(qiáng)（在第4天最強(qiáng)），此后的14 d內(nèi)，廣東魴的氧化壓力與抗氧化防御響應(yīng)達(dá)到較穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，氧化損傷與各抗氧化應(yīng)激指標(biāo)均有所下降（如表2所示）。而Pandey等（2008）對(duì)翠鱧（Channa punctate）的研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬暴露30 d之間，翠鱧的SOD和GSH含量呈下降趨勢(shì)，CAT也在暴露7 d后開(kāi)始下降。另外，砷對(duì)翠鱧的90 d脅迫研究顯示了GSH的波動(dòng)變化特征，暴露前7 d，GSH含量增加，而到第60天則下降，到第90天時(shí)又有所恢復(fù)(Allen和Rana，2004)。然而，短期（96 h）急性銅暴露（5.5 mg·L-1Cu）致使長(zhǎng)須魚丹（Esomus danricus）抗氧化防御機(jī)制受損，表現(xiàn)在SOD和CAT在暴露期間持續(xù)下降，MDA水平持續(xù)增加（Vutukuru等，2006）?？梢?jiàn)，魚類種類、暴露金屬種類、暴露方式等差異均可致使魚體內(nèi)氧化應(yīng)激響應(yīng)的差異。因此，在利用魚類的氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)作為重金屬污染的生物標(biāo)記物前，應(yīng)盡可能均一化毒物濃度，掌握該生物標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，排除其他影響因素的干擾。

氧化應(yīng)激指標(biāo)作為污染生物標(biāo)記物的另一重要前提條件是：其誘導(dǎo)需與污染暴露劑量存在特定的劑量—響應(yīng)關(guān)系。本研究中，在亞急性銅、鎘暴露下廣東魴幼魚最敏感時(shí)期的氧化應(yīng)激響應(yīng)與暴露濃度之間符合二次曲線關(guān)系，這與以往報(bào)道鎘暴露下鰱組織中SOD中的拋物線關(guān)系一致（呂景才等，2002），而二次曲線頂點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的暴露濃度值可被認(rèn)為是魚體對(duì)重金屬污染從適應(yīng)到中毒反應(yīng)的閾值，低于該閾值時(shí)的金屬暴露是魚體適應(yīng)性反應(yīng)，而高于閾值時(shí)的抑制作用可能是中毒反應(yīng)的前兆。盡管廣東魴各氧化應(yīng)激指標(biāo)最高時(shí)對(duì)應(yīng)的中毒反應(yīng)閾值有些微差異，但各氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)中，又屬SOD和CAT活性最為靈敏，這兩者分別在暴露濃度為0.056 TU和0.059 TU時(shí)達(dá)最高值，小于該暴露濃度閾值的銅、鎘重金屬暴露均會(huì)隨著暴露濃度的增加，SOD和CAT響應(yīng)值增加，而我國(guó)現(xiàn)有的漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）對(duì)銅、鎘規(guī)定的暴露濃度之和為0.02 TU，位于本研究的響應(yīng)指標(biāo)中毒閾值以內(nèi)，理論上SOD和CAT水平可作為污染程度的指示。而GSH則響應(yīng)最為迅速，暴露第1天后即迅速響應(yīng)。因此，對(duì)于重金屬銅、鎘暴露而言，廣東魴幼魚機(jī)體GSH屬于快速響應(yīng)生物標(biāo)記物，而SOD和CAT屬于靈敏響應(yīng)標(biāo)記物。

廣東魴幼魚在銅、鎘脅迫下的氧化應(yīng)激響應(yīng)之間存在密切的關(guān)系（如表3所示）。其中，SOD與CAT活性之間相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.87（n=40），這極可能與氧化壓力下SOD和CAT的催化作用機(jī)制有關(guān)。當(dāng)抗氧化底物缺乏時(shí)，魚體內(nèi)SOD結(jié)合CAT共同構(gòu)成了機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化壓力的另一道防線，通常情況下CAT活性的增強(qiáng)或減弱會(huì)和SOD保持一致，因?yàn)檫@兩種酶互相協(xié)作，同步反應(yīng)（Asagba等，2008）。其中，SOD的抗氧化防御是將超氧陰離子自由基（O2˙-）歧化為O2和H2O2，CAT則進(jìn)一步催化H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，從而在一定程度上阻止氧化損傷的發(fā)生，維持機(jī)體氧化與抗氧化防御動(dòng)態(tài)平衡（Roméo等，2000）。這在對(duì)其他種類如叉尾鮰（Wallago attu）（Pandey等，2003），尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）（Asagba等，2008）、奧尼羅非（Oreochromis niloticus）（Atli等，2006）的研究中亦得到驗(yàn)證。然而，另一些研究則發(fā)現(xiàn)CAT的誘導(dǎo)或是抑制與SOD并不同步（Sampain等，2008），這可能與機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化壓力產(chǎn)生的CAT巰基易被金屬結(jié)合后失活的速度和效率差異有關(guān)（Kono和Fridovich，1982）。此外，T-AOC與GSH含量的相關(guān)系數(shù)亦高達(dá)0.84，這意味著對(duì)廣東魴而言，GSH在其總抗氧化活力當(dāng)中發(fā)揮重要的作用，因此GSH含量的變化決定著其T-AOC變化趨勢(shì)。T-AOC是機(jī)體總的抗氧化能力的指標(biāo)，包括GSH及GSH以外的酶促和非酶促抗氧化體系產(chǎn)物的總抗氧化能力。GSH是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白的巰基化合物。它可以清除細(xì)胞內(nèi)的O2˙-、H2O2、LOOH等自由基（Srikanth等，2013）。GSH含量迅速升高是廣東魴應(yīng)對(duì)重金屬產(chǎn)生ROS的脅迫的一種快速自我保護(hù)機(jī)制。廣東魴幼魚在亞急性銅、鎘脅迫下應(yīng)激指標(biāo)的正、負(fù)相關(guān)性則反映出機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化脅迫的相互依賴或代償作用的動(dòng)態(tài)變化。

本研究中銅、鎘聯(lián)合暴露對(duì)廣東魴幼魚的脅迫作用效果表明了他們之間潛在協(xié)同作用的方式，而Roméo等（2000）的研究則表明銅、鎘脅迫下歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）的抗氧化壓力響應(yīng)不同。

今后可通過(guò)廣東魴幼魚組織、器官的響應(yīng)研究進(jìn)一步驗(yàn)證并闡明銅、鎘對(duì)廣東魴幼魚的聯(lián)合作用方式及其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本文探討了珠江流域特有魚類廣東魴幼魚在應(yīng)對(duì)水體亞急性銅、鎘脅迫時(shí)的機(jī)體氧化應(yīng)激響應(yīng)。GSH對(duì)銅、鎘暴露則在第1天后即迅速響應(yīng)至高值，SOD與CAT則在暴露第4天顯示高值。GSH、SOD和CAT被誘導(dǎo)至高值期間與重金屬銅、鎘暴露濃度呈顯著的二次曲線關(guān)系。其中，SOD與CAT則在暴露濃度為0.05～0.06 TU時(shí)即靈敏響應(yīng)，且SOD與CAT之間具強(qiáng)相關(guān)性，可作為水體污染的潛在生物標(biāo)記物。

但廣東魴幼魚的氧化應(yīng)激響應(yīng)隨脅迫時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化較大，故在將其應(yīng)用于自然環(huán)境中重金屬污染的指示前仍需開(kāi)展進(jìn)一步研究，尤其在各種重金屬聯(lián)合毒性作用方式，及以毒性單位均一化法確定毒物暴露濃度與響應(yīng)指標(biāo)之間的劑量—效應(yīng)關(guān)系及其影響因素方面的研究需要進(jìn)一步深入。

致謝：

衷心感謝中科院南海海洋研究所張黎研究員對(duì)本文英文摘要的潤(rùn)色。

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Responses towards Oxidative Stress of Juvenile Guangdong Bream Megalobrama terminalis to Cu2+and Cd2+Exposure

ZENG Yanyi, LAI Zini*, YANG Wanling, GAO Yuan, WANG Chao, LIU Qianfu, ZHANG Weizhen, ZHAO Lina
Fishery Eco-environment Monitoring and Evaluation Function Laboratory of the Pearl River Valley, Experimental Station for Scientific Observation on Fishery Resources and Environment in the Middle and Lower Reaches of Pearl River, Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China

Guangdong bream (Megalobrama terminalis) is an endemic fish species with great economic value in the Pearl River watershed. It has been listed in the National Aquatic Germ-plasma Resources Conservation Project in China. However, as the natural habitats of the fishes is continuously destroyed, and heavy metals and other water pollution problems are aggravated, many endemic fish resources represented by Guangdong bream is sharply declined in recent years. In this study, a series static bioassay were carried out on Guangdong bream juvenile in order to find the appropriate biomarkers to improve the evaluation and early warning system for pollution in the Pearl River watershed. The fish were exposed to the separated or combined Cu2+and Cd2+at low, medium, and high toxic concentrations responding to 0.01 TU, 0.03 TU and 0.11 TU, respectively(1 TU, toxic unit is the 48 h LC50of Cu2+or Cd2+in Guangdong bream juvenile) for 14 days. The substances and enzymes towards to oxidative stress including malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined on day 1, 4, 7, and 14 during the exposure period. The results show that MDA, GSH concentrations and T-AOC, SOD and CAT activities (all of the five substances were calculated by protein content, similarly hereinafter) in the juvenile bream were within the range of 1.08～7.34 nmol·mg-1, 0.42～22.82 mg·g-1, 0.10～1.32 U·mg-1, 2.45～13.24 U·mg-1and 0.01～0.09 U·mg-1, respectively, and varied according to exposure time and exposure concentrations.. The concentrations of GSH, MDA and the T-AOC activity in the fish were significantly increased after Cu2+and Cd2+exposure, and rapidly reached the peak on day 1. The relationship between GSH level and the exposure concentration (c, in the unit of TU) of Cu2+and Cd2+were well fitted with the conic curves GSH=-2112(c-0.084)2+18.1, r=0.847, n=10, P=0.012 on day 1, and the toxic concentration threshold was calculated as 0.084 TU. The other two substances SOD and CAT activities were also significantly elevated after Cu2+and Cd2+exposure and reached the peak on day 4. The relationships between SOD, CAT activities and the exposure toxic units of Cu2+and Cd2+were also well fitted with the conic curves SOD=-2073(c-0.059)2+14.3, r=0.840, n=10, P=0.014; CAT=-21.2(c-0.056)2+0.102, r=0.877, n=10, P=0.006, respectively on day 4, and the thresholds concentrations were 0.059 TU to SOD and 0.056 TU to CAT. In summary, GSH was the most rapid response substance to the exposure, while SOD and CAT activities were more sensitive to the exposure and more correlated to each other. This study suggests that GSH, SOD and CAT in the juvenile M. terminalis could be developed as potential biomarkers for water pollution in the Pearl River watershed.

Megalobrama terminalis; heavy metal; oxidative stress and response; toxic unit; biomarker

X171.5

A

1674-5906（2014）12-1972-08

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（201101I02）；2015年農(nóng)業(yè)部部門預(yù)算（物種資源保護(hù)）項(xiàng)目（C977）

曾艷藝（1983年生），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樗蛑亟饘傥廴旧鷳B(tài)與毒理。E-mail: yanyizeng84@163.com

*通訊作者：E-mail: znlai01@163.com

2014-09-12

曾艷藝，賴子尼，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜. 廣東魴幼魚對(duì)銅、鎘脅迫的氧化應(yīng)激響應(yīng)及其指示意義[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(12): 1972-1979.

ZENG Yanyi, LAI Zini, YANG Wanling, GAO Yuan, WANG Chao, LIU Qianfu, ZHANG Weizhen, ZHAO Lina. Responses towards Oxidative Stress of Juvenile Guangdong Bream Megalobrama terminalis to Cu2+and Cd2+Exposure [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(12): 1972-1979.

河流重金屬污染及其對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)的危害日益嚴(yán)重，已引起全球范圍的普遍關(guān)注（Sikder等，2013）。魚類作為河流生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在受重金屬污染時(shí)，其氧化應(yīng)激響應(yīng)指標(biāo)比形態(tài)可見(jiàn)癥狀的反應(yīng)要靈敏、迅速，可作為污染指示。在受重金屬脅迫的氧化壓力下，魚類為保護(hù)自身免受氧毒性損傷啟動(dòng)一套抗氧化防御系統(tǒng)，以維持體內(nèi)活性氧代謝的平衡。魚類的抗氧化防御系統(tǒng)包括小分子非酶抗氧化劑如谷胱甘肽、維生素C、維生素E，及超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等抗氧化物酶（Martinez-Alvarez等，2005）。以往的大量研究結(jié)果表明，重金屬脅迫下，魚類的抗氧化防御響應(yīng)在不同魚及其發(fā)育生長(zhǎng)階段的差異性顯著（Giari等，2007；Asagba等，2008；Atli和Canli，2010；Liu等，2011；Liu等，2011；曹亮，2010）。廣東魴（Megalobrama terminalis），隸屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、魴屬，是具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珠江流域特有魚類（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所等，1990）。但自80年代以來(lái)，以廣東魴為代表的當(dāng)?shù)靥赜恤~類資源急劇下降（陸奎賢，1990），除航道建設(shè)、采砂、水壩等工程項(xiàng)目破壞魚類固有的棲息地及阻斷洄游通道外，水環(huán)境污染可能也是重要的原因（李捷等，2010）。作者所在的珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)珠江中下游水環(huán)境狀況發(fā)現(xiàn)，銅和鎘是該水域主要重金屬污染物，這主要與珠江上游

重金屬相關(guān)工、礦業(yè)迅猛發(fā)展過(guò)程中廢液、廢渣等排放有關(guān)。這些重金屬污染物大部分沉積于江底，隨江水、洪水沖刷向下游遷移，并在河口富集，而河口又是珠江魚類早期生長(zhǎng)育肥的場(chǎng)所，長(zhǎng)此以往，必然對(duì)當(dāng)?shù)佤~類，尤其是對(duì)重金屬敏感的仔稚幼魚，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。此外，謝文平等對(duì)珠三角魚類養(yǎng)殖池塘水和底泥的調(diào)查中亦發(fā)現(xiàn)銅、鎘污染的情況較為嚴(yán)重（謝文平等，2014）。然而，國(guó)內(nèi)外有關(guān)環(huán)境污染因子對(duì)廣東魴的生態(tài)毒理研究資料缺乏，僅有少量報(bào)道（許淑英等，1998；李琳等，2013；曾艷藝等，2014；Zeng等，2014）。為此，作者在延續(xù)銅和鎘對(duì)珠江天然仔魚和幼魚的急性毒性效應(yīng)研究的基礎(chǔ)上，以該流域特有種類廣東魴幼魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)一步開(kāi)展了銅、鎘亞急性脅迫對(duì)其氧化應(yīng)激效應(yīng)的研究，以期找出適宜的生物標(biāo)記物，完善珠江流域污染評(píng)價(jià)與預(yù)警體系，從而為珠江魚類資源的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。