張玉昆

[摘要] 目的 探討肺纖維化小鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)及意義。 方法 將60例C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為實驗組、治療組和對照組，其中實驗組和治療組采用博萊霉素誘導(dǎo)建立肺纖維化小鼠模型，其余20例健康小鼠作為對照組，采用免疫組化SP法測定實驗組和對照組肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。并采用格列衛(wèi)對治療組進(jìn)行干預(yù)，對治療前后肺組織中MMP-9和TGF-β1的表達(dá)情況進(jìn)行比較。 結(jié)果 對免疫組化測得的光密度值進(jìn)行比較，實驗組MMP-9和TGF-β1的值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。將治療組中進(jìn)行干預(yù)的20只小鼠進(jìn)行MMP-9和TGF-β1的光密度值測定，干預(yù)前后進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 肺纖維化小鼠肺組織中MMP-9和TGF-β1呈高表達(dá)，格列衛(wèi)對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度可能有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 肺纖維化小鼠；MMP-9；TGF-β1；格列衛(wèi)

[中圖分類號] R563.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）04-0014-03

肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病病理特征之一，間質(zhì)性肺疾病病變早期以彌漫性肺泡炎為主，其后逐步出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化。特發(fā)性肺纖維化是其中最常見的一個類型，該病發(fā)病機(jī)制不明，臨床預(yù)后很差，中位生存期僅2.8年，目前無特效的治療方法[1]。因此，深入研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制并探索有效的治療途徑是目前研究的熱點和重點[2]。本研究通過建立肺纖維化小鼠動物模型探討肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白表達(dá)及意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取由廣州醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心提供的健康雌性C57BL/6小鼠60只作為研究對象，均為周齡4～6周、體重16～18 g的健康清潔級小鼠。將上述小鼠置于室溫18℃～22℃，濕度60%～70%，通風(fēng)良好的同一清潔飼養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

動物模型的建立[3，4]：將60只小鼠隨機(jī)分為3組：實驗組（n=20）、治療組（n=20）和對照組（n=20）。小鼠固定于手術(shù)臺，采用水合氯醛進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹腔按照（300～400）mg/kg劑量注入，取頸部切口長約1.5 cm，逐切開顯露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙進(jìn)行6號細(xì)針穿刺，實驗組按照5 mg/kg推注博萊霉素生理鹽水溶液，對照組推注等量無菌生理鹽水溶液，逐層縫合切口后，反復(fù)翻轉(zhuǎn)小鼠2 min，保持藥液布滿雙肺。小鼠清醒后常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)。造模1周后，將實驗組中20只小鼠及對照組的20只分別處死取肺組織。具體步驟：采用氯胺酮腹腔麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，沿胸骨中線打開胸腔，剔除結(jié)締組織和脂肪組織、氣管支氣管及其他非肺組織成分，取肺后，常規(guī)給予10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后擬行免疫組化檢測。治療組中20只小鼠則每天按照50 mg/（kg·d）給予格列衛(wèi)腹腔內(nèi)注射進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)1周后，同法取小鼠肺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測。采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照說明書中的操作步驟進(jìn)行操作。采用美國IPP6.0專業(yè)圖像分析軟件對MMP-9和TGF-β1免疫組化結(jié)果中的光密度值進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組與對照組肺組織中MMP-9和TGF-β1表達(dá)情況的比較

實驗組與對照組由免疫組化測得的光密度值進(jìn)行比較，MMP-9和TGF-β1的值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 治療組干預(yù)前后肺組織中MMP-9和TGF-β1表達(dá)情況的比較

將治療組中進(jìn)行干預(yù)的20只小鼠進(jìn)行MMP-9和TGF-β1的光密度值測定，干預(yù)前后進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

間質(zhì)性肺疾病是一組肺彌漫性疾病，包括有200多個病種，其發(fā)病原因可能與遺傳、免疫損傷、病菌感染、職業(yè)性的粉塵接觸及放射治療等因素有關(guān)。目前，有多種學(xué)說，包括Th1/Th2因子失衡學(xué)說、肺泡炎性學(xué)說、脂質(zhì)過氧化學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說。目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在肺纖維化的過程中發(fā)揮了重要作用，多種因素參與了肺纖維化的形成[5，6]。

研究表明，TGF-β1在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β1主要來源于單核巨噬細(xì)胞，與成纖維細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分裂、增殖，參與結(jié)締組織生成。動物實驗表明，TGF-β1通過介導(dǎo)肺泡炎癥及損傷，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生氨基多糖和膠原，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，最終促進(jìn)肺纖維化的形成[7，8]。研究還顯示，MMP在肺間質(zhì)中廣泛存在，人體肺間質(zhì)膠原合成與降解代謝保持一種動態(tài)平衡，當(dāng)肺組織中MMP表達(dá)及活性增高時，肺組織中正常膠原蛋白被纖維性間質(zhì)取代，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成[9]。

研究表明，格列衛(wèi)（甲磺酸伊馬替尼）是一種小分子酪氨酸蛋白激酶抑制物，主要治療慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）、胃腸道間質(zhì)瘤，格列衛(wèi)的抗纖維化作用是在治療CML的過程中逐步被注意到的。其后相關(guān)的臨床及基礎(chǔ)研究證實格列衛(wèi)對多種組織器官具有抗纖維化的作用。目前普遍的觀點認(rèn)為格列衛(wèi)通過阻斷細(xì)胞外基質(zhì)合成抑制纖維化的作用[10]。

本研究通過建立肺纖維化小鼠動物模型，證實實驗組小鼠的肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高，提示MMP-9和TGF-β1蛋白的異常表達(dá)與肺纖維化關(guān)系密切，與相關(guān)研究結(jié)果一致[10]。本研究嘗試用格列衛(wèi)干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，結(jié)果顯示，實驗組小鼠經(jīng)格列衛(wèi)干預(yù)后，肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白的表達(dá)干預(yù)前后顯著下降，提示格列衛(wèi)可能通過抑制MMP-9和TGF-β1蛋白的表達(dá)進(jìn)而減少肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，但格列衛(wèi)對肺纖維化抑制作用還有待于進(jìn)一步研究[11]。

綜上所述，肺纖維化小鼠肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白呈高表達(dá)，格列衛(wèi)對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠纖維化程度可能有抑制作用，為肺纖維化的治療提供新的治療思路，有關(guān)的機(jī)制及療效還有待進(jìn)一步的深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Verma R，Brahmankar M，Kushwah L，et al. Evaluating the inhibitory potential of sulindac against the bleomycin-induced pulmonary fibrosis in wistar rats[J]. Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（3）：769-778.

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[8] 徐麗娜，劉倩，王建海，等. IL-31與TGF-β1在小鼠肺纖維化過程中的表達(dá)及關(guān)系[J]. 菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué)報，2011，23（4）：1-3.

[9] 魏路清，董彥，李振華，等. 阿托伐他汀對肺纖維化大鼠肺泡灌洗液MMP-9和TIMP-1的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，40（1）：64-70.

[10] 李莉，李燕芹. 格列衛(wèi)對肺纖維化小鼠的干預(yù)機(jī)制[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2009，8（4）：365-370.

[11] Wu J，Ling C，He H，et al. Effect of compound panax notoginsenoside granules on TGF-beta1/smads signaling pathway in rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2013，29（9）：927-930.

（收稿日期：2013-11-14）

綜上所述，肺纖維化小鼠肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白呈高表達(dá)，格列衛(wèi)對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠纖維化程度可能有抑制作用，為肺纖維化的治療提供新的治療思路，有關(guān)的機(jī)制及療效還有待進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2013-11-14）

綜上所述，肺纖維化小鼠肺組織中MMP-9和TGF-β1蛋白呈高表達(dá)，格列衛(wèi)對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠纖維化程度可能有抑制作用，為肺纖維化的治療提供新的治療思路，有關(guān)的機(jī)制及療效還有待進(jìn)一步的深入研究。

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[11] Wu J，Ling C，He H，et al. Effect of compound panax notoginsenoside granules on TGF-beta1/smads signaling pathway in rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2013，29（9）：927-930.

（收稿日期：2013-11-14）