晏和娟，伍莉娟，鄭小江，周防震

（湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000）

藤茶活性成分二氫楊梅素對明膠酶的影響

晏和娟，伍莉娟，鄭小江，周防震*

（湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000）

該文探討藤茶活性成分二氫楊梅素（DMY）對明膠酶酶活性和酶蛋白表達量的影響。通過收集不同質(zhì)量濃度DMY處理的人乳腺癌細胞的條件化培養(yǎng)液上清液，取等蛋白質(zhì)含量各處理組樣本液，進行相同條件的明膠酶譜實驗，以此檢測DMY對明膠酶蛋白表達量的影響；收集未經(jīng)過DMY處理的細胞培養(yǎng)液上清液，等量體積上樣進行明膠酶譜實驗的SDS-PAGE電泳部分，移除凝膠中SDS后置于含有不同質(zhì)量濃度DMY的孵育液中進行孵育，以此檢測DMY對明膠酶活性的影響。結(jié)果表明，20～80 μg/mL的DMY對明膠酶活性未見明顯影響，但以劑量依賴方式抑制明膠酶蛋白的表達。這表明DMY抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制可能是通過抑制明膠酶酶蛋白的表達量，而不是通過抑制該酶活性來完成的。

二氫楊梅素；明膠酶；明膠酶譜

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）大量存在于藤茶（Ampelopsis grossedentata）幼嫩莖葉中。近來的報道表明，DMY具有抗氧化、抗炎、抗突變、止咳、化痰、抗菌和抗腫瘤[1-5]等多種生理活性。已有研究表明，DMY能抑制B16小鼠黑色素瘤細胞纖維連接蛋白、層粘連蛋白和基質(zhì)膠的粘附，并且抑制細胞向重組基底膜的侵襲[6-7]。先期研究也顯示DMY能抑制MDA-MB-231人乳腺癌細胞和小鼠乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。這些結(jié)果表明DMY是一個潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移制劑。

大量研究表明，腫瘤細胞分泌的明膠酶也叫IV型膠原酶，包括基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），可降解IV型膠原、明膠和Ⅴ型膠原等基底膜成分，在癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。因為細胞從原發(fā)灶傳播至遠端必須穿透血管壁IV型膠原含量豐富的基底膜[10]。已有研究表明藤茶活性成分DMY對明膠酶有重要影響[11]，但是具體影響酶活性還是酶的表達量，抑或二者同時被抑制，尚未有定論。明膠酶譜法是明膠酶檢測的重要方法之一。該方法是KLEINER等1994年建立的基于非還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，是最早建立的明膠酶檢測方法，也是目前最常用的明膠酶檢測方法，能區(qū)分酶原和活化型酶兩種形式，具有費用低、簡便、敏感等特點[12]。因此，本實驗以明膠酶譜法研究藤茶活性成分DMY對明膠酶蛋白表達量及水解活性的影響，以檢測其可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細胞MDA-MB-231：暨南大學生物工程研究所。DMY：由華南理工大學工業(yè)技術研究總院提供（純度99%）；二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒、青霉素-鏈霉素雙抗溶液：碧云天生物技術公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清：Gibco公司；細胞培養(yǎng)板：Corning公司；考馬斯亮藍、過硫酸銨、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺：北京鼎國生物技術有限公司；Triton X-100、L-甘氨酸、甘油、三羥甲基氨基甲烷（Tris）和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：廣州國奧生物科技有限公司；明膠購于美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州凈化設備公司；CO2細胞培養(yǎng)箱、臺式低溫高速離心機：美國Thermo公司；倒置生物顯微鏡：Olympus公司；微量移液器：德國Eppendorf公司；SDS-PAGE電泳套裝：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 DMY對明膠酶蛋白表達量的影響

參考侯曉麗等[13]的方法，將處于對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞接種于6孔培養(yǎng)板，調(diào)節(jié)細胞數(shù)量為2×105個/孔，每孔液體總體積2 mL。分別以質(zhì)量濃度0、20μg/mL、40μg/mL和80 μg/mL的DMY處理48 h后收集各組細胞培養(yǎng)上清液（條件化培養(yǎng)液），按試劑盒說明進行BCA法蛋白定量。取等蛋白含量各組樣本液（23 μg），加入上樣緩沖液，按固定順序加樣于含0.1%明膠的10%SDS-PAGE凝膠孔中，80 V電壓條件下進行電泳，待蛋白進入分離膠后，改為120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底部。取下凝膠，置于洗脫液（2.5%Triton X-100）中洗脫2次，每次30 min，然后用水漂洗3 min，換為孵育液（含0.05 mol/L Tris，0.05 mol/L氯化鈣和0.2 mol/L氯化鈉，pH 7.6），37℃溫箱50 r/min振蕩孵育40 h。0.1%考馬斯亮藍染色，脫色（體積分數(shù)30%甲醇，10%乙酸）至藍色背景下白色條帶清晰可見。實驗重復3次。

1.3.2 DMY對明膠酶明膠水解活性的影響

以1.3.1中未經(jīng)DMY處理的MDA-MB-231細胞培養(yǎng)上清液為樣本，以等量體積上樣進行明膠酶譜實驗的聚丙烯酰胺凝膠電泳部分，孵育前不用DMY處理，孵育過程分別置于含有不同質(zhì)量濃度DMY的孵育液中進行。其他條件和處理同1.3.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY對明膠酶蛋白表達量的影響

條件化培養(yǎng)液經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量后，進行等量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，膠塊在不含DMY的孵育液中孵育40 h。明膠酶譜實驗結(jié)果顯示見圖1，DMY以劑量依賴方式顯著減少條件培養(yǎng)液中明膠酶的蛋白表達量，包括72 ku前體型、68 ku和62 ku活化型MMP-2蛋白以及92 ku MMP-9蛋白。

圖1 二氫楊梅素對MDA-MB-231細胞明膠酶蛋白表達量的影響Fig.1 Effect of DMY on gelatinase protein expression of MDA-MB-231 cells

2.2 DMY對明膠酶明膠水解活性的影響

SDS-PAGE凝膠電泳后，膠塊在含有不同質(zhì)量濃度的DMY的孵育液中孵育40 h。明膠酶譜實驗結(jié)果顯示見圖2，不同質(zhì)量濃度的DMY（0、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL）處理后，MMP-2（72 ku、68 ku和62 ku）和MMP-9（92 ku）明膠水解條帶與對照組未見明顯改變，表明DMY對明膠酶明膠水解活性沒有顯著影響。

圖2 二氫楊梅素對MMP-2和MMP-9明膠水解活性的影響Fig.2 Effect of DMY on gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9

早期的研究表明，人纖維肉瘤HT1080細胞條件化培養(yǎng)液明膠酶譜實驗中發(fā)現(xiàn)有4條帶，其中1條是92 ku的MMP-9和3條不同水解程度的MMP-2，分別是72 ku、68 ku和62 ku[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)液明膠酶譜實驗也呈現(xiàn)出4條帶（圖1和圖2），不同的是其68 ku和62 ku條帶不大規(guī)則，特別是68 ku MMP-2處的條帶呈現(xiàn)發(fā)散狀態(tài)，原因可能與其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關，在電泳過程中發(fā)生了蛋白質(zhì)的降解，這與前人報道的明膠酶譜實驗容易導致蛋白降解及部分酶活性丟失的結(jié)論是一致的[12]。

SDS-PAGE電泳后利用含陽離子去垢劑（Triton X-100）的洗脫液洗脫去除SDS，這一過程中引發(fā)了明膠酶酶原蛋白體外活化機制，酶原在凝膠內(nèi)除掉一個約10 ku的小肽，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿福到饽z中相應部位的明膠。已經(jīng)被激活的明膠酶在去除SDS后也可以恢復酶活性[15]。這些是92 ku前體MMP-9和72 ku前體MMP-2能降解明膠的原因。該實驗中未見MMP-9的活化形式條帶出現(xiàn)，可能暗示人乳腺癌細胞條件化培養(yǎng)液中MMP-9蛋白的穩(wěn)定性要遠遠強于MMP-2蛋白。

3 結(jié)論

通過明膠酶譜實驗，檢測藤茶活性成分二氫楊梅素對明膠酶酶蛋白表達量和水解活性的影響。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度（20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL）的藤茶活性成分DMY不影響明膠酶活性，卻顯著影響明膠酶蛋白表達量，說明其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制可能是通過抑制明膠酶酶蛋白的表達量，而不是通過抑制該酶活性來完成的。

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Effect of active ingredient dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata on gelatinases

YAN Hejuan,WU Lijuan,ZHENG Xiaojiang,ZHOU Fangzhen*
(School of Biological Science and Technology,Hubei Minzu University,Enshi 445000,China)

The effect of dihydromyricetin(DMY)on gelatinase activities and gelatinase proteins expression was investigated.Human breast cancer cells were treated by different concentrations of DMY.The conditioned media were collected,and equal amount of proteins sample were analyzed by gelatin zymography,which helped to detect the effect of DMY on gelatinase proteins expression.Supernatant without DMY pretreatment were collected,and equal volume samples were loaded to conduct SDS-PAGE part of the gelatin enzyme spectrum experiment.After removal of SDS,the gels were incubated in incubation buffer containing different concentrations of DMY,by which to detect the effect of DMY on gelatinase activities. Result showed that 20-80 μg/ml DMY showed no obvious effect on gelatinases activities,but inhibited the gelatinases proteins expression in a dose-dependent manner.The DMY’s anti-tumor mechanism could be by restraining the gelatinases proteins expression,rather than by inhibiting the gelatinase activities.

dihydromyricetin;gelatinase;gelatin zymogram

R730.53

A

0254-5071（2014）10-0081-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.019

2014-07-26

湖北民族學院博士啟動基金項目（MY2012B010）；湖北民族學院大學生創(chuàng)新訓練項目（2013Z071）

晏和娟（1991-），女，本科生，研究方向為生物工程。

*通訊作者：周防震（1976-），男，副教授，博士，研究方向為酶工程與生物制藥。