鄭虹

（福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300）

紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的響應(yīng)面優(yōu)化

鄭虹

（福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300）

采用Box-Benhnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析，對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵工藝條件為培養(yǎng)時間、初始含水量和大米裝量分別為17 d、25.4%、53.3 g/250 mL，在此條件下，洛伐他汀的產(chǎn)量可達15.35 mg/g，與預(yù)測值(14.73 mg/g)較為接近。結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的條件合理可行。

紅曲霉；洛伐他汀；固態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面分析

紅曲霉（Monascus ruber）屬于真菌門，子囊菌亞門，不整囊菌綱，散囊菌目，紅曲科，紅曲霉屬。紅曲霉能產(chǎn)食用色素，在我國具有上千年的食用歷史，在食品著色、食品防腐及醫(yī)療上具有廣泛的應(yīng)用前景[1-6]。近年來國內(nèi)外在紅曲霉的研究過程中主要是集中在菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝和提取測定方法等方面[7-13]。紅曲霉能夠產(chǎn)生多種活性代謝物質(zhì)，主要有紅曲色素、麥角固醇、γ-氨基丁酸、洛伐他汀類化合物及其他活性產(chǎn)物等[14]。

紅曲霉所產(chǎn)生的洛伐他汀不僅能夠抑制膽固醇的合成還能增加膽固醇的分解代謝[15]。此外，洛伐他汀在多項藥理實驗研究結(jié)果還表明，其對腎臟具有保護作用；能預(yù)防和治療膽結(jié)石、抗腫瘤、刺激骨骼形成；對動脈硬化、糖尿病都有很好的治療作用[16]。洛伐他汀引起了廣大國內(nèi)外專家學(xué)者的研究興趣，并分別對其功能性、安全性以及作用機理、分子結(jié)構(gòu)、代新途徑等宏觀與微觀水平上進行了深入研究，并取得了引人注目的成果[17-18]。但我國對洛伐他汀類藥物開發(fā)較晚，在產(chǎn)率和提取率上與發(fā)達國家有較大差距。本研究利用響應(yīng)面法對紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，對提高發(fā)酵水平，降低成本具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉（Monascus ruber）：由本實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

（2）種子培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，NaNO35 g，MgSO41 g，KH2PO41 g，水1 000 mL，pH自然。121℃滅菌20 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：丁優(yōu)米50 g，初始含水量50%。121℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

丁優(yōu)米：超市；洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750紫外可見分光光度計：日本島津公司；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；H1850臺式高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；THZ臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲霉活化及種子液制備

4℃冰箱保存的紅曲霉接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d；挑取1～2環(huán)孢子接種于種子培養(yǎng)基，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.3.2 單因素試驗

大米裝量對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響：250 mL三角瓶中分別裝20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、70 g、80 g的大米，按5%的接種量接入種子液，30℃靜置培養(yǎng)18 d，測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量。

培養(yǎng)時間對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響：按5%的接種量接入種子液，以大米的裝量為30 g，30℃靜置培養(yǎng)8 d后，每隔2 d取樣，測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量。

初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的蒸餾水，使培養(yǎng)基的初始含水量達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，按5%的接種量接入種子液，以大米的裝量為30 g，30℃靜置培養(yǎng)18 d，測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量。

以上每個試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理采用DPS和Excel軟件處理。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

采用Design Expert 8.05軟件設(shè)計試驗[19-20]。采用Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)時間、初始含水量、大米裝量3個因子，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，因素及水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels for BBD experiments

1.3.4 樣品中洛伐他汀的含量測定

采用雙波長紫外分光光度計法[21]測定樣品中洛伐他汀的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品64 mg，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇配制成64 mg/mL的母液，分別吸取一定量母液，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇配制稀釋液質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL、6.4 mg/mL、9.6 mg/mL、12.8 mg/mL、16.0 mg/mL、19.2 mg/mL、22.4mg/mL、25.6 mg/mL、28.8mg/mL、32.0 mg/mL。用雙波長的方法測定各稀釋液的吸光度值A(chǔ)264nm和A254nm，并求其二者差值△A（A264nm-A254nm）。

樣品中洛伐他汀的測定：稱取0.2 g發(fā)酵培養(yǎng)物，用20 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇于超聲波提取2 h，5 000 r/min、4℃離心10 min除去不溶雜質(zhì)，收集取上清液，上清液進行吸附層析除去色素和雜質(zhì)，流出液定容至100 mL，測定溶液的A264nm和A254nm，求其二者差值△A（A264nm-A254nm），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中洛伐他汀的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

以洛伐他汀質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，△A為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lovastatin

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.049 1 x-0.024 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 單因素對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響

2.2.1 大米裝量對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響

250 mL三角瓶中分別裝20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、70 g、80 g的大米，將活化后種子液按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)18 d，測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量，結(jié)果見圖2。

物料的裝量是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一，裝量太多，通氣性不好，不利于發(fā)酵過程的散熱；同樣裝量太少，造成資源浪費。由圖2可知，洛伐他汀產(chǎn)量隨著大米量的增加而增加，當(dāng)大米裝量為30 g時，洛伐他汀產(chǎn)量達到最大值為7.81 mg/g，之后隨著大米裝量的增加，洛伐他汀的產(chǎn)量反而逐漸減少。微生物在生長過程中會產(chǎn)生大量的熱量，對于固態(tài)發(fā)酵，物料是靜置的，培養(yǎng)基的傳熱性能較差，只有當(dāng)試驗容器內(nèi)裝有合適量的大米時，才有利于紅曲霉洛伐他汀的合成。因此試驗中以大米的裝量為30 g/250 mL時最佳。

2.2.2 培養(yǎng)時間對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響

以大米的裝量為30 g/250 mL，30℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)至8 d后，每隔2 d測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of culture time on lovastatin yield

紅曲霉積累產(chǎn)物的過程是一個動態(tài)的過程。由圖3可知，紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀的量剛開始隨培養(yǎng)時間的延長而增加，當(dāng)培養(yǎng)至18 d時，洛伐他汀含量達到最大值為12.96 mg/g，之后隨著時間的延長，洛伐他汀含量反而減少，因此發(fā)酵時間就以18 d為最適。

2.2.3 初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響

將種子液按5%接種量接種于不同初始含水量的發(fā)酵培養(yǎng)基，以大米的裝量為30 g/250 mL，30℃靜置培養(yǎng)時間為18 d，測定發(fā)酵培養(yǎng)物中洛伐他汀的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 初始含水量對洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of initial water content on lovastatin yield

初始含水量是影響菌株固態(tài)發(fā)酵的主要因素之一，因此研究了初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量的影響。由圖4可知，紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀含量先是隨培養(yǎng)基中初始含水量的增加而增加，直到初始含水量為20%時，洛伐他汀含量達到最大值，即14.15 mg/g，之后洛伐他汀含量隨著初始含水量的增加反而減少。可能是由于培養(yǎng)基主要成分是大米，初始含水量越高，大米的黏度越大，大米黏度太大不利于紅曲霉菌絲的生長，進而影響到洛伐他汀的積累，最佳的初始含水量使大米達到一個松而不黏的狀態(tài)。結(jié)果表明，當(dāng)初始含水量為20%時，大米松而不黏，因而有利于紅曲霉洛伐他汀的積累。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.3.1 二次回歸擬合及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇培養(yǎng)時間（X1）、初始含水量（X2）、大米裝量（X3）3個因素為變量，洛伐他汀產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of Box-Behnken design

利用軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型的P=0.008 7，失擬P=0.477 5，回歸極顯著，失擬不顯著，說明所創(chuàng)建的模式合適。該模型的校正系數(shù)R2Adj=0.772 7，說明該方程與實際情況擬合較好，預(yù)測值和實際值的相關(guān)性較高，可用該模型對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的最優(yōu)發(fā)酵條件進行理論預(yù)測。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Variance analysis of response surface quadratic model

由回歸方程各項方差分析表明，大米裝量對洛伐他汀產(chǎn)量影響顯著，而培養(yǎng)時間與初始含水量之間的交互作用對洛伐他汀產(chǎn)量的影響不顯著，培養(yǎng)時間與大米裝量、初始含水量與大米裝量之間交互作用不顯著。同時由軟件分析得出模型的極值點，當(dāng)培養(yǎng)時間為17 d，初始含水量為25.4%，大米裝量為53.3 g/250 mL時，洛伐他汀產(chǎn)量的理論預(yù)測最大值為14.73 mg/g。

2.3.2 響應(yīng)面及其等高線圖

利用軟件Design Expert 8.05繪制出響應(yīng)面及等高線圖。結(jié)果見圖5。

圖5反映了培養(yǎng)時間、初始含水量、大米裝量3個因素的兩兩交互作用對洛伐他汀產(chǎn)量的影響。由圖5可知，培養(yǎng)時間與初始含水量、培養(yǎng)時間與大米裝量、初始含水量與大米裝量的等高線呈橢圓形，兩兩因素間交互作用顯著。

2.4 回歸模型的驗證試驗

圖5 各因素交互作用對洛伐他汀產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effect of interaction between each factors on lovastatin yield

為了檢驗?zāi)Ｐ偷目尚行?，在預(yù)測最佳條件下進行發(fā)酵試驗。紅曲霉在優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，洛伐他汀產(chǎn)量可達到15.35 mg/g，比優(yōu)化前（5.52 mg/g）提高了1.8倍，與理論預(yù)測值（14.73 mg/g）較為接近，表明預(yù)測值與實際值有較好的擬合性，可見該模型可用于預(yù)測紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的實際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，運用軟件Design Expert 8.05建立了洛伐他汀產(chǎn)量與培養(yǎng)時間、初始含水量、大米裝量3個因素的二次多項式回歸模型，經(jīng)驗證試驗證明該模型的理論預(yù)測值與實際值有較好的擬合性，說明該模型可用于紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的試驗預(yù)測。并得出最優(yōu)發(fā)酵條件，即培養(yǎng)時間為17 d，初始含水量為25.4%，大米裝量為53.3 g/250 mL，在此條件下，洛伐他汀的產(chǎn)量達到15.35 mg/g，比優(yōu)化前提高了1.8倍。

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Optimization of solid-state fermentation conditions of Monascus for lovastatin production by response surface methodology

ZHENG Hong
(School of Ocean Science and Biochemistry Engineering,Fuqing Branch of Fujian Normal University,Fuqing 350300,China)

In order to optimize the solid-state fermentation of Monascus for lovastatin production response surface methodology(RSM)and Box-Behnken design analysis was employed.The results showed that the optimized conditions were fermentation time 17 d,initial water content 25.4%, and rice content 53.3 g/250 ml.Under this condition,the highest lovastatin production was 15.35 mg/g,close to the predicted value 14.73 mg/g.This study proved that RSM could be efficiently applied in optimizing the solid-state fermentation conditions of Monascus for lovastatin production.

Monascus;lovastatin;solid-state;response surface methodology

TQ920.1

A

0254-5071（2014）10-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.018

2014-08-21

福建師范大學(xué)福清分校省級重點學(xué)科建設(shè)基金項目（20120326）

鄭虹（1981-），女，實驗師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。