（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院/徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州 221006）

江蘇徐州市雞白痢沙門氏菌的分離鑒定與耐藥性分析

李華坤，孫 朋

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院/徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州 221006）

[目的]調(diào)查徐州地區(qū)雞白痢沙門氏菌的耐藥性。[方法]從徐州不同地區(qū)分離鑒定了19株雞白痢沙門氏菌，并對19株雞白痢沙門氏菌分離株進(jìn)行了藥敏試驗。[結(jié)果]該地區(qū)雞白痢沙門氏菌的多重耐藥率為94.7%，多重耐藥譜為PG-MY-DOX-TET-AMP的菌株百分比為42.1%，對青霉素和林可霉素耐藥率為100%，而對氨芐西林、四環(huán)素和新霉素耐藥率在50%以上，對頭孢唑啉和強(qiáng)力霉素耐藥率為40%～50%，對頭孢氨芐和復(fù)方新諾明耐藥率為20%～30%，對氟苯尼考、阿米卡星和環(huán)丙沙星未出現(xiàn)耐藥菌株，對氟苯尼考和頭孢曲松高敏菌株在80%以上。[結(jié)論]徐州地區(qū)雞白痢沙門氏菌的多重耐藥情況比較嚴(yán)重。

雞白痢沙門氏菌；分離鑒定；耐藥性；耐藥率；藥敏試驗；多重耐藥率；多重耐藥譜

今年雞白痢病在徐州地區(qū)明顯呈現(xiàn)上升趨勢，對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)雞業(yè)造成了很大損失，為指導(dǎo)該病的防控，我們從徐州各地區(qū)采集了疑似雞白痢沙門氏菌病料，并進(jìn)行了分離鑒定，對其耐藥性進(jìn)行了分析，旨在給當(dāng)?shù)胤揽毓ぷ魈峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

血清瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱公司。DMBA210型數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪）、WJ-80-III型CO2培養(yǎng)箱（南京庚辰）、TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭）、CHB-100型恒溫金屬水浴鍋（杭州大和）、LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）、生化反應(yīng)管（杭州天和）、超凈工作臺、振蕩器、各種微量移液器等。

1.2 細(xì)菌分離

在徐州各縣區(qū)養(yǎng)雞場或農(nóng)戶采集肝臟和心臟等臟器有疑似沙門氏菌感染的禽類病料。無菌采取典型病死雞的肝臟和膽囊組織，參照文獻(xiàn)[1]三區(qū)劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取

白色透明的可疑菌落傳代，經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢。

1.3 生化試驗

從分離出的菌株純培養(yǎng)物中挑取單個典型菌落，按照常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18-24 h，觀察結(jié)果。

1.4 16s rRNA基因測序

將分離細(xì)菌采用煮沸裂解法制備細(xì)菌模板，按照16s rDNA Bacterial Identifcation PCR Kit（寶生物工程（大連）有限公司）方法操作，PCR擴(kuò)增出產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，將目的片段送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 藥敏試驗

選用18種徐州地區(qū)常用的抗菌藥物，采用Kirby-Bauer 法，參照（CLSI/NCCLS）2012版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果?？咕幬镉校悍侥峥迹╢orfenicol，F(xiàn)FC）、諾氟沙星（norfoxacin，NOR）、慶大霉素（gentamycin，GEN）、頭孢唑啉（cefazolin，CEF）、阿米卡星（amikacin，AMK）、強(qiáng)力霉素（doxycycline，DOX）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、青霉素（penicillin G，PG）、新霉素（neomycin，NEO）、復(fù)方新諾明（selectrin，SXT）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO）、林可霉素（Lincomycin，MY）、環(huán)丙沙星（ciprofoxacin，CIP）、頭孢氨芐（cefalexin，CLX）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

分離菌在血清瓊脂培養(yǎng)基上中等大小、邊緣整齊、表面光滑濕潤、乳白色的圓形菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上能長出形態(tài)相似的無色透明菌落。鏡檢結(jié)果顯示該細(xì)菌為G-、散在、小球桿菌。將分離得到的19株疑似沙門氏菌分別命名為S1-S19。

2.2 生化試驗

分離的細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甲基紅試驗陽性，不能發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)生α-甲基葡萄糖苷，不產(chǎn)生吲哚，不分解尿素，VP試驗陰性，符合沙門氏菌的生化特征。

2.3 16s rRNA測序結(jié)果

用試劑盒擴(kuò)增分離菌的16s rRNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得到500 bp的目的片段，最后將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對。參考株雞白痢沙門氏菌菌株來自于GenBank序列號為GU183553.1。分離菌16s rRNA 序列同源性達(dá)97%以上（圖1）。

圖1 19株沙門分離菌的16S rRNA序列同源性

2.4 藥敏試驗

2.4.1 耐藥分布。從表1可以看出，徐州地區(qū)雞白痢沙門氏菌對PG、MY耐藥率為100%，而對AMP、TET、NEO 3種藥物耐藥率在50%以上，對CEF、DOX耐藥率為40%～50%，對CLX、SXT耐藥率為20%～30%，對NOR、GEN、CTX、KAN、ENR、CRO耐藥率為10%～20%，對FFC、AMK和CIP未出現(xiàn)耐藥菌株，但出現(xiàn)不同程度的

中度敏感菌株，對FFC和CRO高敏菌株占80%以上。

表1 19株雞白痢沙門氏菌對18種常用抗菌藥物的耐藥率

2.4.2 多重耐藥。從表2可以看出，19株雞白痢沙門氏菌分離株中除S3之外，其余18株對三類或三類以上抗菌素同時耐藥，多重耐藥百分率為94.7%，其中多重耐藥譜為PG-MY-DOX-TET-AMP的菌株占42.1%，16株對5種以上抗生素耐藥，其中5耐菌株占26.3%，6耐菌株占36.8%，7耐、8耐、10耐及12耐菌株各占5.3%。

表2 19株雞白痢沙門氏菌的多重耐藥譜

3 討論

本研究中采集的病料為新鮮病料，及時進(jìn)行了細(xì)菌的分離，沒有進(jìn)行冷凍保存，避免了冷凍對分離率的影響，我們共分離鑒定了19株雞白痢沙門氏菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離鑒定的雞白痢沙門氏菌對PG耐藥率達(dá)100%，對AMP耐藥率達(dá)73.7%，對TET、NEO和DOX均呈現(xiàn)較高的耐藥率，此結(jié)果與代娟娟[2]、王娟等[3]研究結(jié)果基本相符。本研究中雞白痢沙門氏菌對CLX、CEF、CTX和CRO的耐藥率分別為26.3%、42.1%、10.5%和10.5%，與程春榮[1]、代娟娟[2]、蔣清蓉等[4]報道的雞白痢沙門氏菌對頭孢類抗生素的耐藥程度性一定的差異。

本研究中，徐州地區(qū)沙門氏菌的多重耐藥率高達(dá)94.7%，表明徐州地區(qū)雞白痢沙門氏菌的耐藥性比較嚴(yán)重。與鄭州[1]、合肥[5]地區(qū)沙門氏菌的多重耐藥譜相比，三者相似處皆為PG-AMP，其結(jié)果表明，隨著青霉素和氨芐西林在獸醫(yī)臨床的廣泛使用，青霉素類抗菌藥物在各地區(qū)的耐藥性均比較嚴(yán)重。而徐州地區(qū)雞白痢沙門氏菌對PG、MY、AMP、TET、NEO等藥物均已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，而對FFC、AMK、CIP、CRO等藥物依然敏感。

潘志明等[6]研究表明雞白痢沙門氏菌的耐藥性與獸醫(yī)臨診上使用的抗菌藥物有關(guān)，根據(jù)我們問診的結(jié)果也顯示，菌株的耐藥譜確實與畜主不合理的使用藥物有關(guān)。為防止耐藥菌株的出現(xiàn)，飼料中不要隨意添加抗菌類藥物，預(yù)防用藥時，要經(jīng)常調(diào)換藥物的種類，或者使用中草藥防治，在治療時應(yīng)通過藥敏試驗，選出敏感藥物，合理使用抗生素，建議在獸醫(yī)臨床上建立健全沙門氏菌耐藥監(jiān)測機(jī)制。

[1]程春榮，安戈，羅琦，等.145株沙門氏菌耐藥性分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，23（4）：256-261.

[2]代娟娟，孫金華，常維山.雞白痢沙門氏菌耐藥性分析[J].山東畜牧獸醫(yī)，2008，29（11）：56-57.

[3]王娟，曲志娜，趙思俊，等.禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J].中國動物檢疫，2009，26（5）：64-65.

[4]蔣清蓉，張德勝，賴守勛，等.四川地區(qū)蛋雞孵化場沙門氏菌調(diào)查[J].四川畜牧獸醫(yī)，2012，39（4）：20-21.

[5]王元蘭，劉軍軍，邵穎，等.源自合肥地區(qū)表觀健康雞的沙門氏菌耐藥性與血清型、基因型相關(guān)性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，40（4）：540-546.

[6]潘志明，焦新安，劉文博，等.雞白痢沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2002，33（4）：377-383.

Identifcation and Analysis of Drug Resistance of Salmonella Pullorum in Xuzhou Area

Li Huakun Sun Peng

（Xuzhou Key Laboratory of Modern Agro-Biotechnology，Xuzhou Vocational College of Bioengineering，Xuzhou 221006）

In order to investigate drug resistance of Salmonella pullorum in Xuzhou，19 strains of Salmonella pullorum were studied for drug sensitivity test in this report. The results showed that the percentage of multiple drug resistance was 94.7%，the multiple-antimicrobial-resist bacteria spectrum of PG-MY-DOX-TET-AMP accounted for 42.1%，the rates of drug resistance of the penicillin G and Lincomycin were 100%，the rates of drug resistance of the ampicillin，tetracycline and neomycin were more than 50%，the rates of drug resistance of the cefazolin and doxycycline were between 40%-50%，the rates of drug resistance of the cefalexin and selectrin were between 20%-30%，no bacterial isolates of resistant to forfenicol，amikacin and ciprofoxacin，the highly sensitive bacterial isolates of the forfenicol and ceftriaxone were more than 80%. Therefore，drug resistance of Salmonella pullorum was very serious in the Xuzhou area.

Salmonella Pullorum；identification and analysis；drug resistance；the rate of drug resistance；drug sensitivity test；multiple drug resistance；the multiple-antimicrobial-resist bacteria spectrum

S855.1

：A

：1005-944X（2014）12-0047-03

徐州市科技計劃項目（XF12C039）