雷 利，彭 姣，祁振強，秦智峰，盧 超

（1.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518057；

2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

豬流行性腹瀉病毒雙抗夾心ELISA的建立

雷 利1，彭 姣1，祁振強1，秦智峰2，盧 超1

（1.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518057；

2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

用豬流行性腹瀉病毒（PEDV）免疫蛋雞后提取抗豬流行性腹瀉病毒的特異性卵黃抗體為捕獲抗體，鼠抗豬流行性腹瀉病毒多克隆抗體為檢測抗體，建立了豬流行性腹瀉病毒病原檢測的雙抗夾心ELISA，其最適包被抗體濃度為1∶4000（12.35μg/mL），鼠抗豬流行性腹瀉病毒的多克隆抗體最佳濃度為1∶6000（10.25μg/ mL），樣品反應(yīng)時間為30min，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶6000，并以O(shè)D450≥0.130作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。該方法與豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、豬流感病毒、大腸桿菌K88、K99、987P、F41等病原無交叉反應(yīng)。對經(jīng)豬流行性腹瀉病毒PCR檢測的100份糞便樣本進行檢測表明，8份PCR檢測陽性樣本中6份為本法陽性；PCR陰性者本法全部陰性。實驗結(jié)果表明該方法具有良好的特異性和敏感性，可用于豬流行性腹瀉病毒的快速檢測。

豬流行性腹瀉病毒；卵黃抗體；雙抗夾心ELISA

豬流行性腹瀉病毒為冠狀病毒科的成員[1]，仔豬有較高的發(fā)病率和死亡率[2]，給某些養(yǎng)豬場帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本實驗用一株豬流行性腹瀉病毒分離株，制備免疫原免疫產(chǎn)蛋雞，收集高效卵黃，分離提純純化制備成特異性抗體；用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法檢測豬嘔吐物及糞便中的腹瀉病毒病原[3]，及早發(fā)現(xiàn)感染豬流行性腹瀉病毒的豬只，提前進行治療并對豬場所有豬只進行健康監(jiān)控[4]。

1 材料和方法

1.1 材料

酶標(biāo)板：Costar公司可拆卸酶標(biāo)板；PEDV特異性卵黃抗體：PEDV毒株（深圳出入境動植

物檢驗檢疫中心自行分離）免疫產(chǎn)蛋雞，提取含抗PEDV病毒的蛋黃，通過硫酸銨沉淀法粗提抗PEDV卵黃抗體，再經(jīng)M蛋白進行親和層析純化（實驗室制備）；鼠抗PEDV多克隆抗體：用PEDV毒株免疫小鼠，采集眼睛血液，離心后取血清，進行純化；酶標(biāo)二抗：購自Sigma公司；陰陽性樣本均由深圳出入境動植物檢驗檢疫中心提供，陰陽性樣本的稀釋度均為1∶10。

1.2 PEDV-IgY特異性卵黃抗體最佳濃度測定

用包被液將PEDV-IgY特異性抗體按不同稀釋倍數(shù)進行稀釋，按照ELISA程序進行測定，比較樣本的OD450值，P/N值最大的確定為最佳包被濃度。

1.3 多克隆抗體最佳稀釋度的確定

將PEDV-IgY特異性抗體按確定的最佳濃度進行包被，再將純化的鼠抗PRDV-IgG多克隆抗體按不同倍數(shù)稀釋，按照ELISA程序進行測定，比較樣本的OD450值，P/N值最大的確定為最佳多抗稀釋濃度。

1.4 最佳封閉液的選擇

用5%的脫脂奶粉、酪蛋白鈉、5%胎牛血清、1%BSA、魚明膠作封閉液，酶標(biāo)儀上讀出OD450值，比較陰陽性樣本的OD450值，確定最佳封閉液。

1.5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的選擇

將多克隆抗體按最佳濃度稀釋后，加入不同濃度的倍比稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，按照ELISA程序進行測定，比較樣本的OD450值，確定酶標(biāo)二抗的最適工作濃度。

1.6 血清作用時間和酶標(biāo)二抗作用時間確定

由以上試驗確定好包被濃度，多抗及酶標(biāo)二抗?jié)舛龋?7 ℃分別作用不同時間，按照ELISA程序進行測定，比較樣本的OD450值，確定最佳反應(yīng)時間。

1.7 陰陽臨界值的確定

按已建立的雙抗體夾心ELISA方法，檢測20份陰性血清，每份設(shè)三個重復(fù)。計算出陰性血清OD450平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），以X+3S的值為陰性和陽性的臨界值。

1.8 特異性檢測

用ELISA方法對本實驗室保存的豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬流感病毒抗原、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88，K99、987P、F41抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，及由深圳出入境動植物檢驗檢疫中心提供的20份陰性血清進行特異性鑒定，并用PEDV抗原作陽性對照，

1.9 臨床樣本檢測

用來自比利美英偉營養(yǎng)有限公司恩平試驗中心經(jīng)PCR所檢測過的100份樣本，其中PCR檢測有8份為陽性的樣本中用本實驗室建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測（實驗結(jié)果另文公布），有6份相同編號的樣本檢測為陽性，其它樣本全部檢測為陰性。

1.10 敏感性實驗

結(jié)合陰陽臨界值判定，建立的雙抗體夾心ELISA方法的敏感性為105（55.930 ng/mL）

2 結(jié)果

2.1 PEDV-IgY特異性卵黃抗體最佳濃度的測定當(dāng)包被濃度為1∶4000（12.35μg/mL）時，P/N值最大（表1），故將此確定為包被濃度。

表1抗體最適稀釋濃度確定

2.2 多抗最佳稀釋度濃度的確定

當(dāng)多抗?jié)舛葹?∶1000（10.25μg/mL）時，P/N值最高（表2），故將此確定為多抗最佳濃度。

表2多克隆抗體最適稀釋度確定

2.3 最佳封閉液選擇

用魚明膠作封閉液時，P/N值最大（表3），故選魚明膠為最佳封閉液。

表3最佳封閉液的確定

表4酶標(biāo)二抗最佳濃度確定

表5樣本最佳反應(yīng)時間的確定

表6陰陽臨界值的確定

表7特異性實驗結(jié)果

2.4 酶標(biāo)二抗最佳濃度

當(dāng)酶標(biāo)二抗作6000倍稀釋時，P/N值最高（表4），故確定此濃度為最佳二抗?jié)舛取?/p>

2.5 樣本最佳反應(yīng)時間確定

當(dāng)樣本作用時間為0.5h時，陽性對照OD值為1.020，接近1.0，陰性對照OD值較低，本底也較低，P/N值最大（表5），故樣本作用時間確定為0.5h。

2.6 陰陽臨界值的確定

按照已建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測10份陰性樣本，計算其OD450的平均值及標(biāo)準(zhǔn)方差，陰陽性臨界值= X +3SD。經(jīng)計算，陰陽性臨界值=0.08427+3×0.015252=0.130 因此把臨界值定為0.130。在陰陽對照成立的情況下，OD450大于0.130就可以判定豬流行性腹瀉病毒抗原陽性，否則，判為陰性（表6）。

2.7 特異性試驗

PEDV只與PEDV抗原發(fā)生反應(yīng)，而不與豬傳染性胃腸炎抗原、豬輪狀病毒抗原、豬流感病毒抗抗原、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88，K99、987P、F41抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，另有20份陰性血清均不產(chǎn)生反應(yīng)，說明建立的雙抗體夾心ELISA方法特異性好。

2.8 敏感性試驗

如表8所示，結(jié)合陰陽臨界值判定，建立的雙抗體夾心ELISA方法的敏感性為105（55.930 ng/mL）。

2.9 臨床樣本檢測

由試驗確定的陰陽臨界值為0.130，陰陽對照和空白對照成立，用來自比利美英偉營養(yǎng)有限公司恩平試驗中心經(jīng)PEDV-PCR所檢測過的100份樣本，其中PCR檢測有8份為陽性的樣本中用本實驗室建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測（檢驗結(jié)果將另文公布），有6份相同

編號的樣本檢測為陽性（表9）。

表8敏感性試驗結(jié)果

表9雙抗體夾心ELISA法檢測不同樣品的抗原

3 討論

豬流行性腹瀉?。≒ED）是由PEDV引起的一種高度接觸性腸道傳染病，發(fā)病特征為嘔吐、水樣腹瀉、脫水，對仔豬具有高效致病率[5]。在自然情況下，PEDV對不同年齡階段豬群都易感，其中7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬多發(fā)死亡率高[6]。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）同屬冠狀病毒屬成員，二者在病毒粒子形態(tài)、臨床癥狀及流行病學(xué)方面極為相似，難以區(qū)分[7]；而且早些年對此病的實驗室診斷主要是采用免疫電鏡法、PCR、直接免疫熒光法、微量血清中和試驗等[8-9]，但是這些方法對實驗室基礎(chǔ)條件及儀器要求較高，不能普遍使用。本研究采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法檢測，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，具有廣泛應(yīng)用前景。

卵黃抗體（IgY）是用抗原免疫蛋雞后產(chǎn)生的免疫球蛋白由血液轉(zhuǎn)入卵黃中形成的[10]，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低，具有開發(fā)功能性食品和新藥的潛能。目前IgY主要用于疾病診斷檢測和防治[11]、食品添加劑及化妝品領(lǐng)域等。而卵黃抗體作為一種高效的生物活性免疫球蛋白，能對一種疾病更好的進行監(jiān)測。目前用卵黃抗體研制成防治仔豬腹瀉病毒藥物的研究較多[12]，但卵黃抗體在雙抗夾心用作包被抗體檢測抗原的研究較少，所以本實驗中利用卵黃抗體這一特異進行疾病的抗原檢測，檢測病毒能早日對豬只情況進行監(jiān)控及早日治療。

此實驗選擇PEDV IgY特異性抗體作為第一抗體包被96孔酶標(biāo)板來捕獲樣品中的抗原，用多克隆抗體作為第二抗體，因為這種特異性抗體可以針對單一抗原決定簇，具有表位特異性，先用PEDV-IgY特異性卵黃抗體包被酶標(biāo)板，特異性的捕獲PEDV抗原，再加入鼠抗PEDV-IgY多克隆抗體，增加了該方法的特異性[13]。通過對ELISA實驗中各項條件的優(yōu)化，本試驗確定了最佳抗體包被濃度1∶4000，多抗最佳稀釋濃度1：6000，最佳封閉液為魚明膠、酶標(biāo)二抗最佳濃度為1：6000、樣本最佳反應(yīng)時間0.5h，顯色時間（37℃，10min）和陰陽臨界值（OD450≥0.13為陽性），有效降低

了非特異性反應(yīng)，保證了檢測方法的準(zhǔn)確性和靈敏性。用所建立方法對傳染性胃腸炎抗原、豬輪狀病毒抗原、豬流感抗原抗原、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88，K99、987P、F41抗原進行交叉反應(yīng)，均為陰性，證實該方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可以用于PEDV抗體的檢測和相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查。

用來自比利美英偉營養(yǎng)有限公司恩平試驗中心經(jīng)PEDV-PCR所檢測過的100份樣本，在PCR檢測8份陽性樣本中，有6份用本實驗室建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測陽性，符合率可達96%。雙抗體夾心ELISA方法已被大量用于動物疫病的臨床診斷，但目前還沒有查到與此方法相同的文獻，報道的大多是抗體檢測，不利于早期發(fā)現(xiàn)病毒感染。本研究建立的PEDV抗體夾心ELISA方法彌補了現(xiàn)有PEDV檢測方法的不足，用本研究建立的夾心ELISA法檢測PEDV抗原非常方便，直接采用糞便、嘔吐物均可作為臨床樣品進行檢測。

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Development of a Double Antiby Sandwich ELISA for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Lei Li1，Peng Jiao1，Qi Zhenqiang1，Qin Zhifeng2，Lu Chao1

（1.Shenzhen Boostie Biological Pharmaceutical CO. ，LTD，Shenzhen，Guangdong 518057；2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen Enter-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518103）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was used to immunize laying hens for preparation of specifc yolk antibody（IgY）as capturing antibody. A double antibody sandwich ELISA（DAS-ELISA）was developed for the detection of PEDV in pigs. The optimal coating concentration of anti-PEDV IgY was 1∶4000（12.35μg/mL）；the optimal concentration of mouse-anti-PEDV polyclonal antibody was 1∶6000（10.25μg/mL）；optimal reaction time was 30 minutes；optimal working concentration of HRP-labelled goat-anti-mouse IgG was 1∶6000；and the positive standard value was OD450≥0.130. The DAS-ELISA showed no cross-reaction with porcine transmissible gastroenteritis virus，porcine rotavirus，Escherichia coli k88/k99/987P/F41. One hundred clinical fecal samples which had been detected by real-time PCR were analyzed by this method. 6 out of 8 real-time PCR positive samples were positive in the DASELISA，and all the negative samples in real-time PCR were negative in the DAS-ELISA. The results indicated that the DAS-ELISA was highly specifc，reproducible and sensitive，and suitable for rapid detection of PEDV.

porcine epidemic diarrhea virus（ PEDV）；IgY；double antibody sandwich ELIS

S852.65

：A

：1005-944X（2014）12-0065-05

深圳市科創(chuàng)委技術(shù)創(chuàng)新計劃專項基金資助項目，No. CXZZ20130320154210829