陳 維 周 濤 呂成余

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）普外科，江蘇省南京市 210006

CX3CL1（Fractalkine）于1997年發(fā)現(xiàn)，是目前CX3C類 趨 化 因 子 中 唯 一 成 員［1］。CX3CR1是CX3CL1的特異性受體，屬于趨化因子受體超家族。CX3CL1／CX3CR1可誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附及游走移行，并介導(dǎo)免疫損傷。近年發(fā)現(xiàn)，CX3CL1／CX3CR1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。但在人胃癌中，有關(guān)CX3CL1／CX3CR1的研究較少。本研究應(yīng)用ELISA和Western Blot法檢測胃癌組織及對應(yīng)癌旁組織中CX3CL1、CX3CR1的表達(dá)情況，探討其在胃癌發(fā)病過程中的作用。

1 資料及方法

1.1 一般資料 選取2012年7月－2013年3月本院普外科手術(shù)切除的胃癌組織30例，男19例，女11例；年齡38～81歲，中位年齡63歲；術(shù)前均未接受化療或放療。術(shù)中取成對的癌組織和癌旁組織（距癌變部位邊界5cm以外且經(jīng)病理證實(shí)無癌變的組織）。

1.2 主要試劑 人CX3CL1ELISA試劑盒購自USCN公司，全蛋白定量試劑盒購自南京凱基。兔抗人CX3CR1抗體為abcam公司產(chǎn)品，內(nèi)參（rabbit β－Actin）購自Immunoway公司，羊抗兔IgG購自Jackson公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELISA方法：將所取組織剪成小塊，加入細(xì)胞裂解液，于勻漿器中勻漿，離心后取上清。依照全蛋白定量試劑盒操作說明，配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測定595nm OD值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得總蛋白濃度。按人CX3CL1ELISA試劑盒操作步驟，檢測待測蛋白樣品，結(jié)合總蛋白濃度，計算出各組織標(biāo)本中CX3CL1含量。

1.3.2 Western blot檢測：取胃癌組織和癌旁組織各100mg，加入400μl裂解液勻漿后，充分裂解。將上清分裝，存于－70℃?zhèn)錂z。取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭G250染液990ml，混勻，測定595nm OD值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求所得濃度。以β－actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70μg，并于95～100℃5min后冰上冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓80V約30min，分離膠100V約90min。將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉封閉液中4℃封閉過夜。加入封閉液和適量一抗抗體CX3CR1（1∶400）。搖床搖蕩4℃孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜4次×10min。將膜與HRP結(jié)合的二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，二抗用封閉液稀釋1∶5 000）室溫下?lián)u蕩孵育2h，然后用TBST充分洗膜4次×10min。將顯影液加于PVDF膜上，曝光，顯影，洗像后觀察結(jié)果，進(jìn)行灰度分析。以CX3CR1條帶灰度值與β－actin條帶灰度值比值表示各組織中CX3CR1的表達(dá)水平（灰度值為條帶密度值及面積值的乘積，設(shè)空白對照相對密度值為0）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，用兩樣本配對t檢驗(yàn)比較胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織的CX3CL1及CX3CR1的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織中CX3CL1的表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示CX3CL1在胃癌組織中的水平高于對應(yīng)癌旁組織（表1）。

表1 CX3CL1、CX3CR1在人胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)比較

2.2 胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織中CX3CR1的表達(dá)

Western blot檢測顯示，30例胃癌組織及對應(yīng)癌旁組織中均存在CX3CR1的表達(dá)。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析表明，CX3CR1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于對應(yīng)癌旁組織（P＜0.05）（表1）。部分組織標(biāo)本W(wǎng)estern blot檢測結(jié)果見圖1。

圖1 部分胃癌和癌旁組織中CX3CR1及內(nèi)參照的表達(dá)

3 討論

趨化因子（chemokines）是分子量為8 000～12 000的小分子細(xì)胞因子，對中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞均有趨化作用，趨化因子通過與相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體超家族結(jié)合發(fā)揮作用。CX3CL1是CX3C類趨化因子中的唯一成員，它由激活的內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞所表達(dá)，與其他趨化因子不同的是，CX3CL1的趨化因子區(qū)域表達(dá)在細(xì)胞膜外粘蛋白樣莖狀結(jié)構(gòu)頂部，它本身又是一種黏附分子，因此除了具有趨化功能外，還具有黏附作用，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附［2］。而其同源受體CX3CR1主要在細(xì)胞毒性效應(yīng)淋巴細(xì)胞（包括NK細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）上表達(dá)，此外腫瘤細(xì)胞也表達(dá)CX3CR1［3］。

目前CX3CL1／CX3CR1在腫瘤中的具體機(jī)制還存在爭議。一些研究表明，作為化學(xué)誘導(dǎo)物，CX3CL1／CX3CR1可激發(fā)白細(xì)胞的抗腫瘤作用，CX3CL1與CX3CR1結(jié)合后可誘導(dǎo)NK細(xì)胞、CD8＋T、CD4＋T向腫瘤細(xì)胞聚集并使其黏附于腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［4～6］。而另一些研究認(rèn)為，CX3CL1可作為黏附分子與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CX3CR1結(jié)合，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用［7，8］。在一些 腫瘤中，CX3CL1上 述 這 種 潛 在 的 抗癌作用因?yàn)槠浯倌[瘤發(fā)展作用而被抵消。這可能就是腫瘤在CX3CL1／CX3CR1系統(tǒng)的作用上形成臨床差異報道的關(guān)鍵因素［9］。在筆者的研究中，通過ELISA法顯示CX3CL1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，western blot檢測結(jié)果證實(shí)了CX3CR1在胃癌組織中的表達(dá)也明顯高于癌旁組織，提示CX3CL1、CX3CR1的過量表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。筆者認(rèn)為存在兩種可能的過程：（1）胃癌組織中CX3CL1高表達(dá)，趨化表達(dá)CX3CR1的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞聚集于胃癌組織，從而使胃癌組織中CX3CR1也呈高表達(dá)；（2）胃癌細(xì)胞自身高表達(dá)CX3CR1，趨化游離的CX3CL1向胃癌組織聚集，使胃癌組織中CX3CL1呈高表達(dá)。這兩種可能性都具有積極的臨床意義：如果是前者，可多一個新的方向研究胃癌的腫瘤基因治療及免疫治療；而如果是后者，則可進(jìn)一步從基因水平探討CX3CR1的表達(dá)在胃癌細(xì)胞生成過程中的角色及腫瘤標(biāo)志物的可能。

當(dāng)前有關(guān)CX3CL1／CX3CR1系統(tǒng)與胃癌關(guān)系的文獻(xiàn)僅有個別報道，Hyakudomi［10］等對158例T2或T3期的胃癌進(jìn)行了CX3CL1的檢測，同時評估NK細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞的浸潤程度后發(fā)現(xiàn)，在無瘤生存期上，CX3CL1高表達(dá)組相比較于低表達(dá)組有著更好的預(yù)后，通過多因素分析結(jié)果顯示CX3CL1表達(dá)是影響胃癌患者無瘤生存期的獨(dú)立因素。目前為止對趨化因子參與的腫瘤免疫學(xué)的研究及治療尚不能形成完全的理論，還需更廣泛的研究來揭示其秘密。筆者希望通過對CX3CL1／CX3CR1系統(tǒng)及其與胃癌關(guān)系的進(jìn)一步研究，為胃癌的診斷和治療中提供新的思路與方法。

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