賈博，戰(zhàn)吉宬，黃衛(wèi)東

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

Cu2+對釀酒酵母酒精發(fā)酵影響的研究進(jìn)展

賈博，戰(zhàn)吉宬，黃衛(wèi)東*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

銅制劑農(nóng)藥應(yīng)用歷史悠久，可有效的防治葡萄霜霉、白粉等病害，在全球葡萄園中使用頻繁和廣泛。不合理使用銅制劑農(nóng)藥會引起葡萄果實的銅污染，升高葡萄汁的銅含量，進(jìn)而影響釀酒酵母正常的酒精發(fā)酵，最終影響葡萄酒的品質(zhì)。綜述了Cu2+對釀酒酵母生長活性和酒精發(fā)酵影響的研究進(jìn)展，并針對已取得的研究成果進(jìn)行展望，旨在為Cu2+對釀酒酵母影響的深入研究提供參考。

Cu2+；釀酒酵母；生長活性；酒精發(fā)酵

銅制劑農(nóng)藥在全球應(yīng)用廣泛（如波爾多液[CuSO4· xCu（OH）2·yCa（OH）2·zH2O]），自問世以來，一直被廣泛用于防治葡萄的霜霉、白粉等病害[1-2]。根據(jù)世界銅發(fā)展大會的統(tǒng)計結(jié)果，硫酸銅作為銅制劑農(nóng)藥的重要組成成分，全球每年的使用量可達(dá)到150 000 t。銅制劑農(nóng)藥被大劑量和無限制地使用，致使早在19世紀(jì)末期，某些地區(qū)葡萄園中的土壤富集了大量的銅，主要以二價陽離子形式存在[2]。由于銅既不會降解，又很少移動，進(jìn)入環(huán)境后主要集中在土壤的耕作層，長期積累在土壤中的銅離子被植物的根吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，使植物器官的含銅量增加，過量的銅會影響植物的正常生長[3]。銅污染跟銅制劑施用的方式方法有著直接的關(guān)系[4]。LA PERA L等[5]發(fā)現(xiàn)，在葡萄園中施用銅制劑（CuCl2·xCuO·4H2O）升高了葡萄果實的含銅量，從而直接導(dǎo)致發(fā)酵液中的銅含量增加。發(fā)酵過程中，長時間接觸銅器具，也會增加發(fā)酵液中的含銅量[6]。當(dāng)發(fā)酵液中Cu2+超過一定含量時，會影響釀酒酵母的正常生長和酒精發(fā)酵[7]。

釀酒酵母是葡萄酒釀造中的關(guān)鍵因子，抗銅性是篩選優(yōu)良釀酒酵母的重要指標(biāo)之一。因此，研究Cu2+對釀酒酵母生長、發(fā)酵性能的影響對解決葡萄酒生產(chǎn)中的銅問題有著十分重要的意義。本文就酵母對銅的吸收、轉(zhuǎn)運以及銅對酵母生長和酒精發(fā)酵的影響進(jìn)行了綜述，并就Cu2+對酵母影響的研究提出了展望。

1 銅對釀酒酵母活性的影響

銅普遍存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，是維持生命體正常生長與代謝的重要微量元素，參與多種生命活動，其主要的生理功能表現(xiàn)在：它是許多酶和蛋白所必需的組分，其中包括有Cu/Zn超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、酪氨酸酶、賴氨酰氧化酶和血漿銅藍(lán)蛋白等[8-9]。許多參與氧化還原反應(yīng)的蛋白質(zhì)活性位點上的銅是有效的電子供體與受體，同時，許多具有氧化功能的酶，需要有銅存在時才有活性。但是銅過量時，就成了氧化還原反應(yīng)的活潑因子，參與Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生有害的氫氧根離子，氫氧根離子會引起細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化、蛋白質(zhì)的氧化以及DNA和RNA分子的解鏈，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[10]。

1.1 釀酒酵母對銅的吸收、轉(zhuǎn)運、代謝及吸附

酵母細(xì)胞內(nèi)的銅離子主要分布在細(xì)胞質(zhì)、高爾基體、線粒體和液泡中。銅在自然界中多以二價形式存在。二價銅在被酵母吸收之前，首先由細(xì)胞質(zhì)膜上FRE1和FRE2基因編碼的鐵還原酶（FRE1、FRE2）還原為一價銅離子。一價銅離子再通過高親和（CTR1、CTR3）和低親和（CTR2、FET4）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[11-12]。培養(yǎng)基中的銅可以調(diào)控CTR1、CTR2、CTR3的表達(dá)，低銅條件下，CTR1、CTR3表達(dá)加強(qiáng)。銅過量時，CTR1、CTR3表達(dá)受抑制，CTR1會出現(xiàn)降解[13]，而CTR3不會[12]。FET4對包括銅、鋅在內(nèi)的其他金屬離子，也具有吸收功能[14]。CTR2對胞內(nèi)儲備銅起一定的作用[15]，CTR2不是銅轉(zhuǎn)運所必需的，甚至在CTR1、CTR3雙缺失的菌株中也不是必需的。MAC1起上調(diào)和下調(diào)以上基因的作用[16]。

銅離子在細(xì)胞內(nèi)與特異的銅伴侶蛋白（copper chaperone protein）結(jié)合，再輸送至各目標(biāo)亞細(xì)胞器，銅伴侶蛋白可以降低銅在細(xì)胞內(nèi)的毒性，現(xiàn)階段，ATX1、COX17、LYS7三個銅伴侶蛋白的功能研究的較為清楚，ATX1將銅離子從細(xì)胞膜上的CTR1轉(zhuǎn)運至分泌途徑中位于后高爾基體囊泡的CCC2，最終運送至細(xì)胞表面的高親和鐵吸收蛋白FET3[17]；通過COX17，銅離子最終到達(dá)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶，其中，線粒體膜蛋白SCO1和COX11是COX17的靶蛋白，SCO1把COX17轉(zhuǎn)運的Cu+插入到細(xì)胞色素C氧化酶的CuA位點，同時，COX11把COX17轉(zhuǎn)運的Cu+插入細(xì)胞色素C氧化酶的CuB位點[18]。最新研究證明，除COX17之外，COX19和COX23也參與向線粒體轉(zhuǎn)運銅[19]；LYS7運送銅離子至銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD），Cu/Zn-SOD穿過線粒體外膜，把Cu+運到線粒體膜間隙[20]，整個吸收和轉(zhuǎn)運銅的過程見圖1。CUP1和CRS5是位于細(xì)胞質(zhì)的金屬硫蛋白，它們能與Cu+相互作用，把多余的Cu+運到液泡中，以消除銅對細(xì)胞的毒害，對于液泡膜銅轉(zhuǎn)運蛋白的作用機(jī)理，現(xiàn)在尚不清楚[21]。

圖1 酵母銅轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控示意圖[21]Fig.1 Copper transporter system and transcriptional regulation in Saccharomyces cerevisiae

近幾年來，關(guān)于釀酒酵母吸附去除重金屬的研究越來越多[22]。MRVCIC J等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在靜置發(fā)酵條件下，經(jīng)過8 h發(fā)酵，葡萄糖、蔗糖、糖漿培養(yǎng)基中的釀酒酵母Cu2+最大吸附量分別為1.16 mg/g、1.2 mg/g和0.81 mg/g，而固定搖床發(fā)酵條件，經(jīng)過6 h發(fā)酵，葡萄糖、蔗糖、糖漿培養(yǎng)基中的Cu2+最大吸附量分別為0.98 mg/g、1.02 mg/g和0.7 mg/g，可見生長條件不同，釀酒酵母對Cu2+的吸附量也不同。釀酒酵母對Cu2+吸附的效果與pH有關(guān)，pH值為5.0～9.0時，可有效的去除重金屬Cu2+濃度0.5 mmol/L；pH為6.5發(fā)酵時，釀酒酵母對Cu2+的吸附量為0.7 μmol/mg[18]?？梢娊湍缚梢源罅课紺u2+，而吸附量受發(fā)酵環(huán)境的影響。

1.2 銅對釀酒酵母生長活性的影響

銅是維持微生物正常生命活動所必需的微量元素，GIORGIO A J等[24]研究證明，在銅缺乏的培養(yǎng)基中，酵母的生長受到了嚴(yán)重的阻礙。Cu2+還會影響酵母對其他金屬的吸收，尤其是對鐵的吸收，進(jìn)而影響酵母的生長，酵母對Fe2+的吸收，需要FET3的參與，而FET3的活性需要Cu2+作為其編碼的酶輔基[17]。低濃度的銅對酵母的生長有益，而高濃度的銅降低酵母的存活率，影響酵母的生長、數(shù)量、種類，碳、氮礦化以及群落的金屬抗性[25]。杜君等[26]研究證明了銅對酵母生活力的影響與銅濃度有關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)，0.05 mmol/L Cu2+對釀酒酵母BH8、AWRI、Freddo的生長基本沒有影響，當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到1.0 mmol/L時，3株釀酒酵母的生長均受到了嚴(yán)重的抑制，并且，高銅逆境增加了酵母細(xì)胞呼吸缺陷型形成的頻率。AVERY S V等[27]證明，當(dāng)Cu2+濃度在5 μmol/L時，釀酒酵母NCYC-1383的生長活力就降低了，而EKUNDAYO E O等[28]從來自尼日利亞貝寧城啤酒廠的啤酒渣中，篩選出的啤酒酵母BY2與BY4分別能耐受3.5 mmol/L和4.2 mmol/L的Cu2+濃度?？梢?，Cu2+對酵母的影響在酵母菌株之間存在很大的差異性。

2 銅對釀酒酵母發(fā)酵影響的研究

圖2 酒精生物合成途徑Fig.2 Ethanol biosynthesis pathway

由圖2可知，酒精發(fā)酵主要由酵母菌在厭氧條件下通過糖酵解（embden-meyerhof-parnas pathway）途徑，將葡萄糖降解為丙酮酸，然后在丙酮酸脫羧酶（pyruvate carboxylase）的作用下，將丙酮酸脫羧形成乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）的作用下生成乙醇[29]。

過量的銅以離子形式進(jìn)入發(fā)酵液時，可能會造成發(fā)酵的停滯或延遲[30-31]。有研究比較了Cu2+逆境對模擬葡萄汁培養(yǎng)基和真實釀酒葡萄汁培養(yǎng)基中酵母發(fā)酵行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05 mmol/L Cu2+嚴(yán)重抑制了模擬葡萄汁的發(fā)酵過程，其產(chǎn)生CO2和酒精的量較對照組顯著降低，而殘?zhí)橇匡@著增多；0.05 mmol/L Cu2+對赤霞珠葡萄汁發(fā)酵過程基本沒有影響。0.50 mmol/L Cu2+幾乎完全抑制了模擬葡萄汁的發(fā)酵過程，只是在一定程度上影響了赤霞珠葡萄汁發(fā)酵過程中CO2、酒精的產(chǎn)量以及對還原糖的利用率，但與對照組沒有顯著差異[32]。銅離子不僅影響發(fā)酵產(chǎn)物，還影響發(fā)酵副產(chǎn)物，F(xiàn)ERREIRA J等[33]研究了Cu2+對VIN13、NT112、RJ11、D80、CC和NT50六株菌發(fā)酵力的影響和Cu2+對這六株菌發(fā)酵過程中的揮發(fā)酸生成量的影響。結(jié)果表明，在0.25 mmol/L Cu2+濃度條件下，菌株NT50、CC、D80的發(fā)酵力基本不受影響，而株菌VIN13、NT112和RJ11發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中殘留了更多的葡萄糖和果糖，同時，六株菌發(fā)酵的揮發(fā)酸生成量均增加，其中，菌株RJ11和NT50的增加量最為顯著。Cu2+對酒精發(fā)酵的影響因菌株不同而異，有的菌株在Cu2+存在時發(fā)酵產(chǎn)生的酒精較對照減少[34]，而有的菌株酒精生成量卻較對照增加[35]。BRANDOLINI V等[36]研究了銅敏感型釀酒酵母SN9和抗銅型SN41，分別在添加32 mg/L和320 mg/L硫酸銅條件下的發(fā)酵過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅敏感型菌株發(fā)酵活性在低Cu2+濃度條件下即受影響，高Cu2+濃度時，發(fā)酵完全被抑制，而抗銅菌株的發(fā)酵活力幾乎不受Cu2+影響，原因是抗銅酵母的細(xì)胞可以吸附大量的Cu2+，抗銅酵母細(xì)胞吸附Cu2+后是否影響發(fā)酵過程及產(chǎn)物還有待于進(jìn)一步研究。

可見，Cu2+通過影響酵母活力，干擾其正常的生理代謝，進(jìn)而影響整個發(fā)酵過程。同時，過量的Cu2+加速了葡萄酒中多酚類物質(zhì)的氧化速率[37]，最終導(dǎo)致葡萄酒的品質(zhì)下降。Cu2+對酵母發(fā)酵的影響在不同菌株之間以及不同發(fā)酵介質(zhì)之間都存在顯著的差異性。對于銅離子如何影響酵母代謝的分子機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步的深入研究。

3 總結(jié)與展望

不合理使用銅制劑農(nóng)藥會引起葡萄果實的銅污染，升高葡萄汁的銅含量，進(jìn)而影響釀酒酵母正常的酒精發(fā)酵。Cu2+對酵母生長的影響在不同菌種之間存在差異性。Cu2+影響酵母酒精發(fā)酵在不同發(fā)酵介質(zhì)之間也存在一定的差異性。當(dāng)發(fā)酵液中的銅離子濃度過高時，會嚴(yán)重抑制酵母的生長和酒精發(fā)酵。而所查閱到的文獻(xiàn)研究都主要集中在Cu2+對酵母細(xì)胞活性以及發(fā)酵基本特性的影響，未見從分子層面揭示Cu2+影響酵母細(xì)胞代謝的機(jī)制；真實葡萄汁中的成分復(fù)雜，如一些具有生物活性的大分子物質(zhì)（花色苷、類黃酮類），可能會對酵母細(xì)胞抗銅具有一定的作用，同時，篩選抗銅菌株或者通過分子技術(shù)改造酵母獲取抗銅酵母，這些方面都是值得進(jìn)一步研究和探討的領(lǐng)域。

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Research advances in effect of Cu2+onSaccharomyces cerevisiaealcoholic fermentation

JIA Bo,ZHAN Jicheng,HUANG Weidong*
(College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Copper-based fungicides application has a long history,which can effectively control grape downy mildew,powdery mildew and other diseases,and it were used frequently and extensively in the vineyards around the world.Irrational use of copper-based fungicides can cause copper contamination on grapes.The increasing copper content in grape juice can affect the normal alcoholic fermentation ofSaccharomyces cerevisiae,and ultimately affect the quality of wine.The purpose of this paper is to provide a comprehensive overview on the effect of Cu2+on the viability and alcoholic fermentation ofS.cerevisiae,and to describe its future prospects of the former studies,aiming to provide a reference for deeper study of the effect of Cu2+onS.cerevisiae.

Cu2+;Saccharomyces cerevisiae;growth viability;alcoholic fermentation

Q939.97

A

0254-5071（2014）11-0006-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.002

2014-09-09

國家十二五科技支撐計劃（2012BAD31B07）；國家自然科學(xué)基金（31471835）；北京市科技計劃（D131100000513003）

賈博（1981-），男，博士，研究方向為葡萄酒微生物。

*通訊作者：黃衛(wèi)東（1961-），男，碩士，教授，研究方向為酵母次生代謝生理和葡萄次生代謝與調(diào)控。