李忠英

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲412004）

產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌種誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

李忠英

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲412004）

為了選育高產(chǎn)檸檬酸菌種，以前期分離到的一株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線（UV）與硫酸二乙酯（DES）復(fù)合誘變后，進行了產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵條件優(yōu)化試驗。結(jié)果表明，選育出黑曲霉UV-DE-3是一株優(yōu)良高產(chǎn)菌株，該菌株的產(chǎn)酸率達到11.54%，比初始菌株（YZ-35）產(chǎn)酸率提高了69.70%；以紅薯為發(fā)酵原料，在初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵時間72 h的優(yōu)化條件下，搖瓶發(fā)酵平均產(chǎn)酸率達到14.24%。

黑曲霉；復(fù)合誘變；檸檬酸；條件優(yōu)化

檸檬酸也稱枸椽酸，是一種極為重要的有機酸，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工、冶金等領(lǐng)域[1-2]。檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)目前以淀粉質(zhì)原料，發(fā)酵菌株以黑曲霉為主。對于檸檬酸發(fā)酵行業(yè)，所用菌株的產(chǎn)酸能力是影響現(xiàn)代檸檬發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。因此，利用各種誘變手段選育高產(chǎn)檸檬酸生產(chǎn)菌一直是國內(nèi)外研究的重點。近年來，國內(nèi)外有些對檸檬酸發(fā)酵菌種的選育研究報道[3-5]，周定等[6]采用采硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變選育一株變異株，其產(chǎn)酸率7.60%。目前野生型菌種的檸檬酸產(chǎn)量相對較低，本研究通過利用紫外線（ultraviolet ray，UV）、化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）對初篩菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35進復(fù)合誘變來提高其產(chǎn)檸檬酸能力，以期提供具有應(yīng)用價值的菌株。與此同時尋找來源廣泛、價格低廉的生產(chǎn)原料一直是生產(chǎn)企業(yè)和研究人員的一個重要研究方向。近年來以紅薯粉作為檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的替代原料日益受到關(guān)注[7-9]。

本研究以性價比較高的產(chǎn)檸檬酸菌株為出發(fā)菌，采用經(jīng)UV和DES復(fù)合誘變處理方法，改進和提升其產(chǎn)酸率及耐酸度。同時對改良后的優(yōu)勢菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化實驗，旨在建立適用于現(xiàn)代檸檬酸發(fā)酵的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35：湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院國家生物制藥基地保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、吡啶（分析純）、NH4NO3（分析純）、K2HPO4（分析純）、溴甲酚綠（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）、硫酸二乙酯（分析純）、醋酐（分析純），酒石酸鉀鈉（分析純）：天津科密歐試劑廠生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂20 g，加水1 000 mL，pH值自然。

固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L、NH4NO33 g/L、K2HPO41.0 g/L、溴甲酚綠0.05 g/L、瓊脂20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘薯（粉）50 g/L、葡萄糖50 g/L、NH4Cl 3.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；80-2型離心機：江蘇省金壇市宏華儀器廠；EL303電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DL-1電爐：天津泰斯特儀器有限公司；XFH-75CA蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LDZX-50FAS恒溫水浴箱：上海瑞仰凈化裝備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：江蘇綠葉凈化科技有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱：河南東明醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；血球計數(shù)板：上海求精生化試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 懸浮液制備

用生理鹽水制備菌懸液，加入玻璃珠振蕩分散，分散程度達90%以上。同時用血球計數(shù)板計數(shù)，控制孢子含量為106～108CFU/mL。

1.3.2 檸檬酸總酸度測定

總酸度測定采用NaOH滴定法[10]：將發(fā)酵液經(jīng)脫脂棉過濾后，用定性濾紙過濾，吸取上清液25 mL于250 mL錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，并滴加0.5%酚酞試劑2～3滴，用0.055 46 mol/L的NaOH溶液滴定，記錄所消耗的NaOH溶液體積。產(chǎn)酸率計算公式如下：

式中：X為產(chǎn)酸率，%；CNaOH為NaOH的物質(zhì)的量，mol/L；V為所消耗的NaOH體積，mL；M檸為檸檬酸摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.3.3 紫外及硫酸二乙酯復(fù)合誘變

參照李忠英等[11]的實驗方法進行，菌懸液先用30 W紫外線照射處理60 s，然后再用物質(zhì)的量為0.2 mol/L的硫酸二乙酯處理20 min[12]，誘變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應(yīng)的菌株活化后接種到250 mL搖瓶中，35℃、180 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)5 d，對發(fā)酵液進行分析并選取優(yōu)勢菌株。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化方法

采用單因素試驗，分別研究發(fā)酵溫度、起始pH值、初始糖度、接種量及發(fā)酵時間對優(yōu)勢菌株發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的影響。在此基礎(chǔ)上，運用正交輔助設(shè)計進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變篩選結(jié)果

菌懸液采用30 W紫外線照射處理60 s，從固體鑒別培養(yǎng)基上選取透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃、180r/min搖床培養(yǎng)5 d，測定產(chǎn)酸率，以出發(fā)菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35為對照，具體結(jié)果見表1。

表1 UV誘變后部分菌株的D/d值與產(chǎn)酸率Table 1 D/d value and acid production rate of some strains after UV mutagenesis

紫外線誘變屬于非電離輻射，作用機理是將被處理的物質(zhì)分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級，致使DNA鏈和氫鍵斷裂等生物學(xué)效應(yīng)，從而提高檸檬酸產(chǎn)量[13]。由表1可知，D/d值與產(chǎn)酸量呈正相關(guān)，D/d值越大，所對應(yīng)的產(chǎn)酸率也越高。結(jié)果表明，UV-5產(chǎn)酸率最高，達到8.46%，比原始菌株（Aspergillus niger）YZ-35提高了24.41%。故選擇UV-5作為下一步DES化學(xué)誘變的出發(fā)菌株。

2.2 硫酸二乙酯誘變篩選結(jié)果

表2 DES誘變后部分菌株的D/d值與產(chǎn)酸率Table 2 D/d value and acid production rate of some strains after DES mutagenesis

UV和DES誘變雖然作用機理不同，但都能使微生物細胞中的DNA突變，其中DES是一種烷化劑，能與DNA中堿基發(fā)生化學(xué)變化，從而引起突變[14]。本研究對UV-5進行DES化學(xué)誘變，選取稀釋度為10-4的菌懸液進行誘變處理，誘變時間為40 min，取0.1 mL涂布培養(yǎng)3 d。從培養(yǎng)基中挑選出D/d值相對較大的10株，分別標(biāo)記為UV-DE-1～UV-DE-10。斜面培養(yǎng)的同時，接入搖瓶中在35℃發(fā)酵5 d，檢測其產(chǎn)酸率，結(jié)果（表2）可知，經(jīng)硫酸二乙酯（DES）誘變后的菌株產(chǎn)酸量進一步提高。其中以UV-DE-3產(chǎn)酸率最高，達到11.54%，比出發(fā)菌株（UV-5）產(chǎn)酸率提高了36.40%。比原始出發(fā)菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35的產(chǎn)酸率提高69.70%。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵溫度對菌株UV-DE-3發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖1可知，溫度對該菌發(fā)酵影響顯著。當(dāng)溫度＜25℃時，產(chǎn)酸率是隨著溫度的升高而逐漸增加。發(fā)酵溫度在32～38℃之間產(chǎn)酸率相對穩(wěn)定，當(dāng)溫度達到35℃時，產(chǎn)酸率達到最佳，達到13.08%，之后隨著溫度的升高而降低。但發(fā)酵溫度＞40℃時，該菌的發(fā)酵力顯著下降，可能是因為大量的糖用于合成菌體和氧化成CO2和H2O，產(chǎn)酸率也會相對會降低[15]。因此，發(fā)酵溫度35℃為宜。

圖1 發(fā)酵溫度對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸率的影響Fig.1 Effects of fermentation temperature on the strain UV-DE-3 acid production rate

2.3.2 初始pH對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸的影響

圖2 初始pH對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸率的影響Fig.2 Effects of initial pH on strain UV-DE-3 acid production rate

檸檬酸主要發(fā)酵菌黑曲霉是嗜酸性微生物，黑曲霉在生長和發(fā)酵檸檬酸不同階段需要不同的pH值，黑曲霉生長的最適pH值為3.0～7.0。初始pH對菌株發(fā)酵的影響結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，UV-DE-3菌能在pH值為3.5～6.5的范圍內(nèi)都能產(chǎn)酸，在pH值為6.0時達到最高。而當(dāng)pH＞6.5時，產(chǎn)酸率會迅速下降。所以該菌的最適初始pH值為5.5～6.5而這也正是實際生產(chǎn)中的正常pH值范圍，說明了UV-DE-3菌可用于實際生產(chǎn)應(yīng)用。因此，初始pH值6.0為宜。

2.3.3 初始糖含量對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸的影響

菌株UV-DE-3在不同初始糖含量中發(fā)酵情況如圖3所示。由圖3可知，該菌在低濃度的葡萄糖中都能較好生長，在初始糖含量10%～20%，產(chǎn)酸率相對穩(wěn)定，再繼續(xù)提高糖含量也不能提高產(chǎn)量，這也表明以紅薯為淀粉基質(zhì)培養(yǎng)基已能滿足生產(chǎn)菌對碳源的需求，不需要額外提供。因此，最適初始糖含量為12%。

圖3 初始糖含量對菌種UV-DE-3產(chǎn)酸率的影響Fig.3 Effects of initial glucose concentration on strain UV-DE-3 acid production rate

2.3.4 轉(zhuǎn)速對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸的影響

檸檬酸發(fā)酵時，需要在發(fā)酵液中維持一定的溶解氧量。通風(fēng)和攪拌是增加培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧的主要方法。隨著菌體生成，發(fā)酵液中的溶解氧會逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 轉(zhuǎn)速對菌種UV-DE-3產(chǎn)酸率影響Fig.4 Effects of rotate speed on strain UV-DE-3 acid production rate

由圖4可知，轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸率影響較為顯著。當(dāng)轉(zhuǎn)速160 r/min時，產(chǎn)酸率最高，為13.50%。隨著菌體生成，發(fā)酵液中的溶解氧會逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。增加培養(yǎng)液中溶解氧對產(chǎn)酸有利。但轉(zhuǎn)速過快，會產(chǎn)生過大的剪切力，損傷細胞而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，最佳轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.3.5 發(fā)酵時間對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵時間對菌株UV-DE-3產(chǎn)酸率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，發(fā)酵時間在36～72 h，產(chǎn)酸率隨著發(fā)酵時間的增加而增高，并在72 h內(nèi)達到最大。在72～96 h內(nèi)，檸檬酸產(chǎn)酸率維持較高水平，＞96 h后，發(fā)酵能力下降?？紤]到生產(chǎn)成本等因素，選擇發(fā)酵時間以72 h為宜。

圖5 發(fā)酵時間對菌種UV-DE-3產(chǎn)酸率影響Fig.5 Effects of Fermentation time on strain UV-DE-3 acid production rate

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，在初始糖含量為12%，選擇以發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、起始pH及發(fā)酵時間作為試驗因素，以產(chǎn)酸率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗表進行設(shè)計并試驗，結(jié)果與分析見表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表3可知，影響發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸大小依次為A＞D＞C＞B，各因素的最佳組合為A2B3C2D2，即菌株UV-DE-3產(chǎn)檸檬酸最優(yōu)發(fā)酵條件為初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵72 h，在該條件下進行驗證試驗，結(jié)果表明，菌株UV-DE-3發(fā)酵產(chǎn)酸率可達到14.24%。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明試驗經(jīng)過紫外線誘變篩選出多株優(yōu)勢菌，以菌株UV-5產(chǎn)酸率最高，達到8.46%，比原始菌株（Aspergillus niger）YZ-35提高了24.41%，再以菌株UV-5菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯誘變后其產(chǎn)酸量進一步提高，其中以菌株UV-DE-3產(chǎn)酸率最高，達到11.54%，比出發(fā)菌株（UV-5）產(chǎn)酸率提高了36.40%。說明紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變對黑曲霉菌種選育較為敏感且效果好。

該工藝以紅薯為發(fā)酵原料，在初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵72 h的優(yōu)化條件下，菌株UV-DE-3搖瓶發(fā)酵平均產(chǎn)酸率可達到14.24%。

[1]陳效蘭，雷鋼鐵.檸檬酸在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2000，21（3）：6-7.

[2]趙琴，李紅，魏婷婷，等.檸檬酸高產(chǎn)黑曲霉菌株選育與發(fā)酵新底物研究[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，25（1）：79-80.

[3]任曉莉，趙林，趙潤柱.檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種黑曲霉的選育[J].食品工業(yè)科技，2010，31（8）：151-153.

[4]SANJAY G,CHANDRA B S.Biochemical studies of citric acid production and byAspergillus niermutants[J].Biotechnol Lett,2002,18(5): 378-380.

[5]HAQ I U,KHURSHID S,ALI S,et al.Mutation ofAspergillus nigerfor hyperproduction of citric acid from black strap molasses[J].World J Microbiol Biotechnol,2001,17(6):35-37.

[6]周定，王建龍.檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉誘變選育的研究[J].微生物學(xué)雜志，1993，13（2）：4-5.

[7]劉璇，錢瑩，段鋼.農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物在檸檬的不同發(fā)酵類型中的應(yīng)用[J].中國釀造，2012，31（7）：15-17.

[8]杜連啟.薯渣生產(chǎn)檸檬酸和檸檬酸鈣的技術(shù)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010（2）：30-31.

[9]高年發(fā)，楊楓.我國檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的創(chuàng)新與發(fā)展[J].中國釀造，2010，29（7）：1-6.

[10]金其榮，張繼民，徐勤.有機酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994.

[11]李忠英，肖楊娟，羅躍中，等.UV與DES復(fù)合誘變選育高產(chǎn)脂肪酶菌株[J].氨基酸和生物資源，2011，33（3）：6-9.

[12]王然，李秀婷，陳存社，等.硫酸二乙酯、紫外及γCO60輻射誘變篩選高產(chǎn)丁二酮菌株[J].中國食品學(xué)報，2010，10（3）：88-91．

[13]潘濤，周劍，虞龍.紫外誘變檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的選育[J].化學(xué)與生物工程，2007，24（1）：50-52.

[14]張克旭，陳寧，張蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004．

[15]SODECK G,KOMINEK,SALZBRUM W.Citric acid production using Aspergillus niger[J].Process Biochem,1981,16(9):931-934.

Mutation breeding of citric acid producingAspergillus nigerand optimization of fermentation conditions

LI Zhongying
(Hunan Chemical Industry Vocation Technology College,Zhuzhou 412004,China)

In order to breed high yield strains of citric acid,using the pre-isolated strain ofAspergillus nigerYZ-35 as starting strain after ultraviolet radiation and diethyl sulfate compound mutation,the experiments of fermentation conditions optimization for citric acid production were carried out. The results showed thatA.nigerUV-DE-3 was strain with high citric acid production,the acid production rate reached 11.54%,which was 69.70% higher than the initial strain YZ-35.Using sweet potato as raw material,under the optimal condition of initial sugar concentration 12%,temperature 35℃,initial pH 6.5,rotated speed 160 r/min,time 72 h,the average acid production rate by shake flask fermentation was 14.24%.

Aspergillus niger;compound mutation;citric acid;conditions optimization

TQ921.1

A

0254-5071（2014）11-0094-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.021

2014-08-17

湖南省教育廳科研一般項目（12C1048）

李忠英（1980-），女，講師，碩士，研究方向為化學(xué)應(yīng)用。