宋慶林，江 梅

(1焦作市人民醫(yī)院，河南焦作454002;2焦作市第二人民醫(yī)院)

苦參堿是豆科植物苦參、苦豆子、廣豆根等中草藥的活性成分，是苦參堿類生物堿的代表，屬于四環(huán)喹諾里西啶生物堿［1］。白血病是常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，約占惡性腫瘤總發(fā)病率的5%，尤其常見于兒童和青少年［2］。研究［3］顯示，苦參及其生物堿對腫瘤細(xì)胞有殺傷和誘導(dǎo)分化的作用，且對正常細(xì)胞不產(chǎn)生破壞作用，還能提高機體免疫功能。2011年3月～2013年3月，我們觀察了苦參堿對白血病HL-60細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA表達(dá)的影響，旨在為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗藥物:苦參堿購自百靈威科技公司，貨號KS-5203，經(jīng)HPLC法鑒定純度＞98%;順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H20040813)。細(xì)胞株:人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。試劑:RPMI1640培養(yǎng)液及四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購自美國Gibco公司;小牛血清購自杭州四季青生物有限公司;Bcl-2及Survivin的RT-PCR引物設(shè)計與合成委托生工生物工程股份有限公司。

1.2 HL-60細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 取懸浮生長的HL-60細(xì)胞，置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37.5℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液傳代1次，至對數(shù)生長期后隨機分為對照組、順鉑組、苦參堿組，均調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL后接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，其中苦參堿組分別加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿，順鉑組加入0.01 mg/mL的順鉑，對照組予等量藥物溶媒。每個劑量組設(shè)6個平行孔，重復(fù)3次。

1.3 HL-60細(xì)胞增殖情況檢測 采用MTT比色法。上述各組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后吸去上清，加入DMSO顯色，避光平行振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測定波長為490 nm處的光密度(OD值)，細(xì)胞生長抑制率(%)=1-實驗孔OD值/對照組OD值。

1.4 HL-60細(xì)胞凋亡率測算及細(xì)胞周期分布檢測

①細(xì)胞凋亡率:采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)。取懸浮生長的HL-60細(xì)胞分為苦參堿組和對照組，苦參堿組予0.1、0.2、0.4 mg/mL的苦參堿培養(yǎng)，對照組同上處理;24、48 h后PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS洗滌1次，用含0.1%Triton X-100的PBS重懸沉淀，冰浴2 min，加入TUNEL檢測液50μL，37℃避光孵育60 min，在熒光顯微鏡下以分析軟件ImagePro檢測各組熒光值。②細(xì)胞周期分布:同①分組、培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，24、4 8 h后分別進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞收集，離心，棄上清液，細(xì)胞沉淀用PBS沖洗2次，在震蕩狀態(tài)下緩慢滴入-20℃預(yù)冷的75%乙醇2 mL，過夜，再用PBS沖洗2次，加入0.01%RNA酶10μL，37℃水浴30 min，加入0.25%的碘化丙啶避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測，CELLQuest軟件分析。

1.5 HL-60細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA的檢測 同1.2中分組、處理 HL-60細(xì)胞，根據(jù)NCBI GenBank中cDNA序列，按照互補原則，兼并Tm值、C+G含量等因素進(jìn)行引物設(shè)計:Bcl-2上游引物為5＇-TGTGTGGAGAGCGTCAAACC-3＇，下游引物為5＇-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3＇;Survivin上游引物為5＇-GTCAGCCCAACCTTCACAT-3＇，下游引物為5＇-GGCGAATCAAATCCATCAT-3＇;根據(jù)上述引物，采用北京全式金實時定量 RT-PCR試劑盒檢測 Bcl-2 mRNA及Survivin mRNA的相對表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用成組t檢驗;計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HL-60細(xì)胞生長抑制率 對照組及順鉑組HL-60細(xì)胞生長抑制率分別為0.04% ±0.00%、51.73%±10.17%，苦參堿組0.5、1、2 mg/mL處理者分別為15.73%±11.50%、40.30% ±6.52%、63.41%±5.94%，順鉑組和苦參堿組均顯著高于對照組，P均＜0.01。

2.2 HL-60細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布 細(xì)胞凋亡率見表1，細(xì)胞周期分布見表2。

表1 兩組HL-60細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

表1 兩組HL-60細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.01

組別 細(xì)胞凋亡率24 h 48 h苦參堿組0.1 mg/mL 10.26* 33.13* 0.2 mg/mL 25.03* 38.65* 0.4 mg/mL 41.02* 52.36*對照組1.58 3.08

表2 兩組HL-60細(xì)胞周期分布比較(%，±s)

表2 兩組HL-60細(xì)胞周期分布比較(%，±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05

組別G1 24 h 48 h S 24 h 48 h G2 24 h 48 h苦參堿組0.1 mg/mL 65.32 66.25 31.59 23.78 5.36 10.62 0.2 mg/mL 73.72*78.09*26.36 21.85 2.98 2.38對照組57.41 62.98 34.02 36.20 1.23 6.08

2.3 HL-60細(xì)胞Bcl-2 mRNA及Survivin mRNA表達(dá) 苦參堿組2.0 mg/mL苦參堿作用者及順鉑組HL-60細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA表達(dá)均顯著低于對照組。詳見表3。

表3 HL-60細(xì)胞Bcl-2及Survivin m RNA表達(dá)比較(±s)

表3 HL-60細(xì)胞Bcl-2及Survivin m RNA表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，ΔP＜0.01

組別Bcl-2 mRNA Survivin mRNA苦參堿組0.5 mg/mL 1.08±0.15 1.56±0.14 1.0 mg/mL 0.90±0.08 1.44±0.08 2.0 mg/mL 0.60±0.11Δ 1.38±0.13*順鉑組 0.81±0.02* 1.31±0.09*對照組1.10±0.11 1.69±0.13

3 討論

白血病的生物學(xué)特征是造血干細(xì)胞增殖失控、分化成熟受阻及正常凋亡機制被抑制。細(xì)胞的分化受增殖能力的影響，即分化程度低的細(xì)胞增殖旺盛、反之則增殖能力低下。近期研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿參與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程，尤其是對消化系統(tǒng)腫瘤和乳腺腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用顯著。但國內(nèi)外有關(guān)其在早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60中作用的研究少見。研究［4］顯示，苦參堿能夠抑制白血病 KG1a(人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株)細(xì)胞的增殖，改變其細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。順鉑是臨床上常用的廣譜抗癌藥之一，主要作用靶點為DNA，可與DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈形成DDP-DNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制，對腫瘤的放療有增敏作用;對機體的消化系統(tǒng)、骨髓、腎臟以及內(nèi)耳等亦可產(chǎn)生毒性損傷。本研究顯示，順鉑組和苦參堿組HL-60細(xì)胞生長抑制率均顯著高于對照組，苦參堿組尤以濃度為2 mg/mL處理者為著。提示苦參堿與順鉑同樣具有抑制HL-60細(xì)胞增殖的作用，并具有劑量依賴性效應(yīng)。

細(xì)胞增殖的速度取決于細(xì)胞周期的長短，而細(xì)胞周期的長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細(xì)胞增殖周期延長。目前，研究抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的方法有染料排斥法(如臺盼藍(lán)拒染法)、集落形成法、1H-TdR摻入法及MTT法等。鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在腫瘤細(xì)胞異常增殖中具有重要作用，是研究腫瘤增殖活性的重要標(biāo)記物之一，主要在G1期和S期合成，是DNA聚合酶的輔助因子，其表達(dá)與細(xì)胞增殖程度密切相關(guān)［5］。本研究顯示，苦參堿組細(xì)胞凋亡率、G1期細(xì)胞比例均顯著高于對照組。提示苦參堿可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并將其增殖阻滯在G1期。細(xì)胞凋亡是一個十分復(fù)雜的生理過程，參與調(diào)控的因子眾多，其中Bcl-2是目前己知的較強的抑制凋亡基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用［6］;Survivin蛋白是內(nèi)源性凋亡蛋白家族(IAPs)的成員之一［7］，在大部分腫瘤組織中有高表達(dá)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子［8］。Bcl-2及Survivin均與腫瘤的發(fā)生及耐藥性密切相關(guān)。本研究顯示，苦參堿組HL-60細(xì)胞Bcl-2mRNA及SurvivinmRNA表達(dá)均顯著低于對照組。表明苦參堿誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)Bcl-2、Survivin基因的表達(dá)實現(xiàn)的。從細(xì)胞動力學(xué)分析，S期比例高的腫瘤患者對化療藥物敏感，但同時殘留腫瘤的再生率亦高，易復(fù)發(fā);G0期高者(即未進(jìn)入增殖狀態(tài)但具有增殖能力的細(xì)胞比例較高者)，化療后也容易引起復(fù)發(fā)。這兩者可以理解為微小殘留病變導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的根源。因此，苦參堿可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖周期增強白血病的化療敏感性。

綜上所述，苦參堿體外可抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)凋亡基因Bcl-2、Survivin表達(dá)有關(guān);此為中國傳統(tǒng)中藥在白血病治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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