李 青，多力坤

(1武警兵團(tuán)指揮部醫(yī)院，烏魯木齊830063;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是最初分離自牛腦的一種相對分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)高度保守的胞質(zhì)蛋白，屬于磷脂酰乙醇胺蛋白(PEBP)家族［1］。目前已發(fā)現(xiàn)，RKIP在人類和鼠、猴、雞等動物的多種組織中表達(dá)［2］。RKIP曾被認(rèn)為與磷脂膜生源和脂類代謝密切相關(guān)，但近年研究［3，4］發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠通過干擾Raf與MEK的結(jié)合抑制Raf-MEK-細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路，從而被更名為RKIP。Raf-MEK-ERK信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用，其過度激活狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］，其特異性抑制分子RKIP被證實為多種腫瘤的抑制蛋白［6］。研究［7～11］表明，RKIP在多種白血病細(xì)胞中表達(dá)缺失，而其過表達(dá)能抑制兒童白血病細(xì)胞CCRF-CEM的Ras-ERK信號途徑，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究構(gòu)建了RKIP的小分子干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體，并觀察了其對白血病細(xì)胞CCRF-CEM化療敏感性的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 兒童白血病CCRF-CEM細(xì)胞系(美國ATCC);鼠抗人ERK單克隆抗體、兔抗人RKIP多克隆抗體、鼠抗人磷酸化ERK(p-ERK)單克隆抗體(美國Santa Cruz)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκB)抗體(Cell Signalinng，MA);PE-Anti Active caspase-3 Kit(Becton-Dickinson，美國)，DNA聚合酶KOD Plus(TOYOBO，日本)，總RNA提取試劑(TRIzol，Invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA連接酶、dNTP(Biolab公司);9-硝基喜樹堿(9NC，Sigma公司);第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen)，ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，DH5感受態(tài)細(xì)胞、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)，P-glycoprotein(Pgp) H1質(zhì)粒載體;蛋白垂直電泳儀(北京六一儀器廠)，F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson，美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，電穿孔轉(zhuǎn)染儀及轉(zhuǎn)染試劑盒(Amaxa，Nucleofector Kit C，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RKIP的siRNA質(zhì)粒載體構(gòu)建 參考Hagan等［11］研究，以RKIP的652-672核苷酸5＇-CCAGGCCGAGTGGGATGACTA-3＇為靶點(diǎn)，由上海吉瑪公司合成含相應(yīng)shDNA的堿基序列，序列如下(下劃線部分為shDNA序列):5＇-GATCCCCCCAGGCCGAGTGGGATGACTATTCAAGAGA TAGTCATCCCACTCGGCCTGGTTTTTA-3＇;3＇-GGGGGTCCGGCTCACCCTACTGATAAGTTCTCTATCAGTAGGGTGAGCCGGACAAAATTCGA-5＇將合成的RKIP shDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和BbsⅠ進(jìn)行酶切、連接，熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選后獲得含質(zhì)粒pGPH1-綠色熒光蛋白(GFP)-RKIP的重組子，提取pGPH1-GFP-RKIP質(zhì)粒并送吉瑪公司測序鑒定，選取測序正確的pGPH1-GFP-RKIP質(zhì)粒用于后續(xù)試驗，菌株于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取CCRF-CEM細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50 IU青霉素和50 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)至良好生長狀態(tài);按照Amaxa Nucleofector操作說明，取對數(shù)生長期CCRF-CEM細(xì)胞，采用X-001程序?qū)①|(zhì)量濃度約1.0μg/μL的pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP質(zhì)粒溶液各2.0μg轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24 h后各取1×106個細(xì)胞用FACS檢測細(xì)胞GFP轉(zhuǎn)染效率，其余細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收獲，用于后續(xù)研究。

1.2.3 CCRF-CEM細(xì)胞內(nèi)RKIP、p-IκBα、p-ERK表達(dá)檢測 采用 Western blotting法。參考前期研究［10］方法，取轉(zhuǎn)染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP 72 h后的CCRF-CEM細(xì)胞各2×106個，在冰板上用細(xì)胞裂解液裂解10min，13 000 r/min離心5min，取上清行蛋白定量;取50μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS/ PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。鼠抗人p-ERK抗體或兔抗人RKIP或鼠抗人ERK按1∶1 000稀釋后標(biāo)記PVDF膜，4℃震蕩孵育過夜，用TBST清洗3次，用相應(yīng)1∶5 000稀釋的二抗標(biāo)記PVDF膜1 h，再次用TBST清洗3次，用增強(qiáng)型發(fā)光液37℃孵育3 min，于暗室感光膠片。

1.2.4 9NC誘導(dǎo)后 CCRF-CEM細(xì)胞調(diào)亡率及RKIP表達(dá)檢測 將轉(zhuǎn)染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP質(zhì)粒72 h后的CCRF-CEM細(xì)胞各2×106個，接種于6孔板，分別以溶劑對照(聚乙二醇200)及5、10、20、50 nmol/L的9NC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。24 h后收集上述細(xì)胞，用PE-Anti Active caspase-3 Kit檢測caspase-3活性(反映細(xì)胞凋亡水平):將受試細(xì)胞用冰PBS清洗2遍，取1×106個用0.5 mL的Cytofix/Cytosperm溶液重懸;冰板放置20 min;離心后棄Cytofix/Cytosperm溶液，取1×106個細(xì)胞用0.5 mL清洗緩沖液洗2遍;加入100μL清洗緩沖液和10 μL抗體混合重懸，室溫放置30 min;再次用1 mL的清洗緩沖液洗2次，用0.5 mL清洗緩沖液重懸，在流式細(xì)胞儀上樣檢測。同上檢測RKIP表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析;細(xì)胞凋亡率的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建情況 經(jīng)吉瑪公司測序序列鑒定，pGPH1-GFP-RKIP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 pGPH1-GFP-RKIP和 pGPH1-GFP的轉(zhuǎn)染效率分別為90.04%、91.32%，能滿足后續(xù)實驗需求。

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)RKIP、p-IκBα、p-ERK表達(dá)變化與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pGPH1-GFPRKIP的細(xì)胞 RKIP表達(dá)水平下調(diào) 92.23% ± 10.23%(見圖1)，p-ERK和p-IκBα表達(dá)明顯上調(diào)，P均＜0.05(見圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)染后CCRF-CEM細(xì)胞RK IP表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染后CCRF-CEM細(xì)胞內(nèi)p-ERK和p-IκBα活性

2.4 9NC誘導(dǎo)后CCRF-CEM細(xì)胞凋亡率 9NC誘導(dǎo)24 h后，轉(zhuǎn)染pGPH1-GFP及pGPH1-GFP-RKIP的細(xì)胞凋亡率分別為58.6% ±7.5%、35.8% ± 5.8%，兩者相比，P＜0.05。

2.5 9NC誘導(dǎo)后CCRF-CEM細(xì)胞RKIP表達(dá)水平9NC處理 CCRF-CEM細(xì)胞 24 h后，20和 50 nmol/L兩種劑量組RKIP表達(dá)水平顯著上調(diào)，且有明顯劑量依賴性(P＜0.05)。

圖3 9NC處理后CCRF-CEM細(xì)胞RK IP表達(dá)變化

3 討論

作為一種近年新發(fā)現(xiàn)的ERK信號通路抑制分子，RKIP能夠通過抑制多種細(xì)胞ERK信號調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)特性［3，4］，且在多種腫瘤的侵襲、生長、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮作用。Briner等［12］對321例食管癌患者RKIP表達(dá)水平進(jìn)行的回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤的RKIP狀態(tài)影響相應(yīng)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移部位RKIP的表達(dá);RKIP下調(diào)與總存活數(shù)(OS)和無病生存率(DFS)相關(guān)，是OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，抑制RKIP下調(diào)可能降低食管癌彌散。Zhao等［13］報道提出，與癌旁組織和正常食管組織相比，食管癌組織的RKIP表達(dá)顯著降低，且與腫瘤淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)。Keller在進(jìn)行前列腺癌體外調(diào)控基因篩查時發(fā)現(xiàn)，高度轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織RKIP表達(dá)水平低于低度轉(zhuǎn)移者，RKIP表達(dá)可抑制前列腺癌侵襲、缺失則反之;體內(nèi)試驗表明，RKIP是前列腺癌轉(zhuǎn)移的抑制基因，對原發(fā)腫瘤生長無影響;RKIP在非腫瘤患者前列腺中高表達(dá)，在50%原發(fā)前列腺癌中低表達(dá)，在大多數(shù)轉(zhuǎn)移癌中低表達(dá)或缺失;此外，原發(fā)前列腺癌RKIP的低表達(dá)預(yù)示早期腫瘤發(fā)生;在小鼠動物模型，RKIP的缺失誘導(dǎo)前列腺癌的抗放射性［14］。上述研究提示，RKIP可能在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

本研究成功構(gòu)建了RKIP的siRNA干擾質(zhì)粒載體，并經(jīng)過電轉(zhuǎn)染方法建立了CCRF-CEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型，且轉(zhuǎn)染后CCRF-CEM細(xì)胞的RKIP表達(dá)顯著下調(diào)，完全可以滿足試驗要求。此為研究RKIP分子在兒童白血病細(xì)胞的生物學(xué)特征中的作用奠定了基礎(chǔ)。本研究還顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞p-ERK和p-IκB表達(dá)也顯著上調(diào)。提示RKIP對CCRF-CEM細(xì)胞ERK和IκB信號通路有強(qiáng)烈的抑制作用。此與文獻(xiàn)［15，16］中有關(guān)前列腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞的研究結(jié)果一致。此外，在9NC處理后，RKIP轉(zhuǎn)染的CCRFCEM細(xì)胞凋亡率顯著低于對照細(xì)胞，且具有濃度依賴性。提示RKIP表達(dá)下調(diào)可增加CCRF-CEM細(xì)胞對9NC的耐藥率，9NC的抗癌作用很可能是通過上調(diào)RKIP完成的。Martinho等［17］新近研究也發(fā)現(xiàn)，宮頸癌對化療藥順鉑的耐藥性與RKIP低表達(dá)相關(guān)。上述研究結(jié)果說明，RKIP表達(dá)下調(diào)可能是多種腫瘤細(xì)胞對化療藥耐受的機(jī)制之一。

總之，本研究成功構(gòu)建了能夠高效干擾RKIP的重組質(zhì)粒載體;9NC誘導(dǎo)的CCRF-CEM細(xì)胞凋亡與RKIP上調(diào)相關(guān)，而RKIP干涉能降低CCRF-CEM細(xì)胞對9NC的化療敏感性。

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