李文明，吳 琦，朱 彧

(1北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司，北京102600;2天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津市腦血管與神經(jīng)變性重點實驗室)

原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤為常見惡性腫瘤之一，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時已經(jīng)無法手術(shù)，化療為重要輔助治療手段［1］。異硫氰酸芐酯(BITC)是存在于花椰菜、卷心菜和水芹菜等十字花科植物中的抗腫瘤成分［2，3］，已被證實具有體外阻滯腦膠質(zhì)瘤細胞周期的作用，但機制尚不明了。本研究觀察了BITC對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U-87 MG細胞周期的影響，并對其機制進行了分析。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細胞系U-87 MG購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所;細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司;BITC購自Sig-ma公司;RT-PCR試劑盒購自Promega公司;細胞周期檢測試劑盒購自BD Biosciences公司;單克隆檢測抗體購自Santa Cruz公司;轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性報告基因檢測試劑盒購自Promega公司;ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司;流式細胞儀CaliburTM購自BD公司;酶標(biāo)儀和PCR儀購自Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 U-87 MG細胞培養(yǎng) 取U-87 MG細胞置于10 cm培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基(90%)的最低必需培養(yǎng)液(EMEM)及10%胎牛血清(FBS)，于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，至對數(shù)生長期后用于下述實驗。

1.2.2 BITC處理及U-87 MG細胞周期分析 取對數(shù)生長期U-87 MG細胞接種于6孔板中，24 h后分別加入PBS或2、5μmol/L的BITC(我們前期研究證實此兩種濃度BITC對U-87 MG細胞的增殖抑制率分別＜5%和＜15%)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集細胞，冷乙醇4℃固定過夜，冷PBS洗滌3次，加入含有RnaseA的碘化丙啶(PI)染液避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.3 U-87 MG細胞周期相關(guān)基因蛋白檢測 采用Western blot法。取上述用于細胞周期分析的U-87 MG細胞，收集細胞并裂解提取蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)以12% SDS-PAGE法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以Cyclin B1(1∶400)、Cdc2(1∶400)、p21(1∶400)、Cdc25C (1∶400)和磷酸化Akt蛋白(p-Akt1∶300)單克隆抗體室溫孵育4 h，檢測目標(biāo)蛋白。洗去一抗，以HRP連接的二抗室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫反應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 U-87 MG細胞周期相關(guān)基因mRNA檢測采用RT-PCR法。取上述用于細胞周期分析的U-87 MG細胞，用Trizol法提取各組總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Cyclin B1上游引物序列:5＇-CTGCCTGGTGAAGAGGAAGC-3＇，下游引物序列:5＇-GAGTGCTAATCTTAGCATGC-3＇;Cdc2上游引物序列:5＇-CCTAGCATCCCATGTCAAAAACTTGG-3＇，下游引物序列:5＇-TGATTCAGTGCCATTTTGCCAGA-3＇，p21上游引物序列:5＇-CACTCCAAACGCCGGCTGATCTTC-3＇，下游引物序列:5＇-TGTAGAGCGGGCCTTTGAGGCCCTC-3＇;Cdc25C上游引物序列: 5＇-CAGGAAGTGCA1TFAGCTGGGATG-3＇，下游引物序列:5＇-ATCGACGGGGAGCGATATAGGC-3＇;β-actin上游引物序列:5＇-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3＇，下游引物序列:5＇-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3＇。94℃變性3 min，按下述條件擴增35個循環(huán):95℃5 s，65℃35 s，72℃60 s;最后72℃延伸5min。以β-actin作為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。1.2.5 NF-κB、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)和真核細胞翻譯起始因子4E(eIF4E)轉(zhuǎn)錄活性檢測 取對數(shù)生長期的U-87 MG細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)染NF-κB、HIF和eIF4E熒光報告質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，試驗孔中分別加入PBS或2、5μmol/L的BITC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)試劑說明書方法檢測NF-κB、HIF和eIF4E的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U-87 MG細胞周期分布變化 經(jīng)PBS和濃度為2、5μmol/L的BITC作用后，U-87 MG細胞G2/M期比例分別為11.7%、34.5%和48.3%，后兩者均顯著高于前者，P均＜0.05。詳見圖1。

圖1 U-87 MG細胞周期分布

2.2 細胞周期相關(guān)基因的蛋白及mRNA表達變化與對照者比較，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG細胞的Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p-Akt蛋白水平均顯著下降，而p21蛋白水平顯著上升(P均＜0.05)，詳見圖2。2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG細胞周期相關(guān)基因mRNA表達亦有顯著差異，與對照者的比例Cyclin B1 mRNA分別為37.5%和18.5%，Cdc2 mRNA分別為68.4%和 20.3%，Cdc25CmRNA表達分別為58.2%和22.9%，p21 mRNA分別為164.3%和224.5%，P均＜0.05。

2.3 U-87 MG細胞NF-κB、HIF和eIF4E的轉(zhuǎn)錄活性 2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG細胞轉(zhuǎn)錄因子的活性均顯著下降，與對照者的比例NF-κB分別為 36.7%和 18.5%，HIF分別為 68.2%和33.8%，eIF4E分別為52.0%和 38.4%，P均 ＜0.05。

圖2 細胞周期相關(guān)基因的蛋白表達

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦部原發(fā)性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用十字花科植物可以降低癌癥的患病率，而其主要成分之一BITC具有抑制腦膠質(zhì)瘤的作用，但具體機制尚無深入研究。多項研究證實，細胞周期蛋白在細胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用，其中Cyclin B1在細胞周期S期階段開始表達，在G2/M階段到達峰值，隨后逐漸消失。Cyclin B1表達異?？蓪?dǎo)致細胞周期紊亂，并進而誘發(fā)惡性腫瘤。Cyclin B1和Cdc2組成的復(fù)合體在G2/M期中發(fā)揮重要作用，Cdc25C可使Cdc2去磷酸化，而活化的Cdc2則可推動細胞進行有絲分裂。大量研究表明，多種惡性腫瘤中存在上述三種基因的異常表達。p21是一種重要的細胞周期調(diào)控蛋白，是p53的下游基因，可通過阻斷增殖細胞核抗原活化DNA聚合酶的活性抑制DNA合成，阻滯細胞周期、抑制細胞分裂，被認為是一種抑癌基因［4～10］。

本研究顯示，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG細胞周期G2/M期比例顯著升高，Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C蛋白和mRNA表達均顯著下調(diào)，p-Akt蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著上調(diào)。提示低濃度的BITC可將U-87 MG細胞周期阻滯在G2/ M期，機制可能為調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因表達。本研究還發(fā)現(xiàn)，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG細胞的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、HIF和eIF4E的轉(zhuǎn)錄活性均顯著下降。提示BITC可抑制U-87 MG細胞Akt/ NF-κB信號通路及其下游靶點HIF和eIF4E的轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)節(jié)下游基因 Cyclin B1、Cdc2、p21和Cdc25C等的表達，最終抑制腫瘤細胞的生長和惡化。

綜上所述，BITC對U-87 MG細胞周期有阻滯作用，機制可能與抑制Akt/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，進而調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因表達有關(guān);此為膠質(zhì)瘤的細胞周期靶點治療提供了新思路。

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