楊曉青，陳旭義，程世翔，劉英富，劉春蓉，李瑞欣，李 娜，李建國

(1天津中醫(yī)藥大學，天津300193;2武警后勤學院附屬醫(yī)院;3武警后勤學院; 4軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生裝備研究所;5北京中日友好醫(yī)院)

神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)是一類具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，體外誘導分化的成體干細胞可用于中樞神經(jīng)損傷疾病及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。找到體外培養(yǎng)NSCs的方法并誘導其分化為特定的神經(jīng)細胞，進而達到神經(jīng)修復和細胞治療的目的乃當今神經(jīng)科學界的研究熱點之一。目前，體外培養(yǎng)及誘導NSCs向神經(jīng)元方向分化的方法很多，力學因素對NSCs增殖與分化的影響也頗受關注［1，2］，良好的細胞生長載體是NSCs力學生物學機理研究的基礎。本研究采用改良型生物硅膠膜作為培養(yǎng)載體，觀察了NSCs的增殖、生長、分化及轉歸情況，旨在為進一步觀察力學因素對NSCs增殖、誘導分化的影響提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為孕16 d的SD胎鼠，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。實驗儀器:SA-300V型全自動高壓滅菌儀(美國賽默飛公司)，自動超純水儀(美國賽默飛公司)，普通倒置顯微鏡及照相裝置(中國奧林巴斯公司)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)，倒置熒光顯微鏡及照相裝置(德國Leica公司)。實驗試劑:熒光標記二抗(Sigma公司)，神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(Pharmingen公司)，明膠、青鏈霉素、胰島素、轉鐵蛋白和葡萄糖(國產(chǎn))，含有F12的DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS均購自Gibco公司。改良型生物硅膠膜厚度為0.25mm，面積為3 cm×3 cm，以環(huán)形膠圈固定于培養(yǎng)器底部;普通培養(yǎng)皿為一次性塑料培養(yǎng)皿，經(jīng)射線消毒滅菌。

1.2 NSCs的分離及分組培養(yǎng) 取上述SD大鼠，乙醚麻醉后置于75%乙醇中浸泡，無菌條件下取出胚胎。D-Hanks液沖洗2次，取胎鼠大腦皮質，置入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，機械研磨、吹打，200目濾網(wǎng)過濾制成單細胞懸液。調整細胞密度為1×106/mL，并隨機分為觀察組和對照組，分別接種于鋪被明膠的改良型生物硅膠膜及普通培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);48 h后全量換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，并加入胰島素、轉鐵蛋白、葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)，隔天再次全量換液。

1.3 NSCs的鑒定 在原代培養(yǎng)48 h后對培養(yǎng)細胞進行Nestin免疫熒光染色鑒定，7 d后對NSCs貼壁分化的細胞進行NSE和GFAP免疫熒光染色鑒定。具體步驟:PBS緩沖液清洗3次，95%乙醇固定30 min，PBS緩沖液清洗3次，加入0.5%的Triton X-100，靜置20 min，再用緩沖液洗3次，BSA封閉20 min，分別加入相應的Nestin、NSE和GFAP一抗，37℃下反應1 h、4℃過夜，緩沖液洗3次，加入相應的熒光二抗，37℃下反應1 h，用緩沖液洗3次，甘油封片。在相差倒置顯微鏡下進行與Nestin、NSE和GFAP相應的熒光激發(fā)，觀察細胞形態(tài)學變化并拍照，在熒光顯微鏡下進行陽性細胞計數(shù)(200倍鏡下選取10個視野，取均數(shù))。陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)標記核×100%。

1.4 NSCs增殖活性檢測 培養(yǎng)后第1、2、3、4、5、6、7天，分別取兩組細胞以胰酶消化，調整細胞密度為1× 105/mL。兩組各取200μL細胞懸液置于24孔培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑藍(MTT)20μL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心、收集孔內細胞，每孔加入150μL的DMSO振蕩10 min，酶標儀490 nm波長下自動檢測吸光度值，繪制生長曲線。每組實驗均重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCs形態(tài)學變化 用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，兩組均見細胞貼壁生長，并形成數(shù)十至數(shù)百個細胞組成的神經(jīng)細胞球;48 h后，細胞增殖形成數(shù)百到數(shù)千個細胞組成的神經(jīng)細胞球，神經(jīng)球邊緣細胞出現(xiàn)突起并逐漸延伸至臨近的神經(jīng)細胞球，其后細胞逐漸分化，并呈多種形態(tài):具有一個或兩個長突起，胞體呈圓形或橢圓性的神經(jīng)元樣細胞;具有多個突起的星形膠質樣細胞;具有多個細突起且不斷分支的少突膠質細胞樣細胞。與對照組相比，觀察組連接神經(jīng)球的突起較多，且較規(guī)律(圖1-a，b，c)。電鏡下可見細胞聚集而成的神經(jīng)球，邊緣有單個神經(jīng)細胞向外爬出，并伸出突起與臨近細胞相連(圖2-a，b)。

圖2 電鏡下原代培養(yǎng)的NSCs

2.2 NSCs鑒定情況 培養(yǎng)48 h后，兩組神經(jīng)細胞球的 NSCs特異標志物Nestin均呈陽性(紅色熒光)。貼壁生長7 d后，NSE陽性細胞的胞質及突起呈綠色，觀察組和對照組陽性細胞率分別為25.14% ±1.98%、24.67%±2.05%(P＞0.05);GFAP陽性細胞呈綠色熒光，觀察組和對照組陽性細胞率分別為59.48%±2.07%、60.87%±1.08%(P＞0.05)。

2.3 NSCs增殖情況 兩組NSCs增殖情況無顯著差異(P＞0.05)，生長曲線見圖3。

圖3 細胞生長曲線

3 討論

干細胞是個體發(fā)育過程中產(chǎn)生的具有多向分化潛能和自我更新能力的一類細胞。目前，利用NSCs分化而成的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞治療脊髓損傷、腦部損傷及腫瘤等術后導致的神經(jīng)損傷已成為國內外研究的熱點［1，2］，其機制可能為神經(jīng)元和膠質細胞可分泌多種營養(yǎng)因子、改善微環(huán)境，從而使軸突再生，使神經(jīng)纖維形成髓鞘［3～5］。NSCs的誘導分化受多種因素的影響［6］，其中力學因素可影響細胞結構、功能并使其骨架重排［7，8］，亦可對胚胎NSCs產(chǎn)生生物力學效應、促進其發(fā)育及分化［9］。

改良型生物硅膠膜是由有機硅化合物制作的生物膜，可作為細胞生長的良好載體。本研究選取孕16 d胎鼠的大腦皮質作為細胞來源，建立胚胎NSCs的體外培養(yǎng)體系［10～13］，觀察組細胞接種于改良型生物硅膠膜上、對照組細胞接種于普通培養(yǎng)皿中。結果顯示，培養(yǎng)第2天，顯微鏡下兩組均可見神經(jīng)細胞球生成，貼壁良好，細胞球邊緣有突起并呈輻射狀向外發(fā)出，神經(jīng)細胞球NSCs特異標志物Nestin均呈陽性;培養(yǎng)第7天，貼壁分化的NSE、GFAP陽性細胞率分別為25%、60%左右，組間比較無顯著差異。提示兩組培養(yǎng)的細胞均可分化為神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質細胞;改良型生物硅膠膜并不影響NSCs的正常分化。此外，通過MTT法檢測細胞活力所得生長曲線顯示，NSCs在改良型生物硅膠膜上的生長及增殖過程與普通培養(yǎng)皿中細胞較一致。提示改良型生物硅膠膜對NSCs的生長具有較好的生物相容性。值得注意的是，改良型生物硅膠膜貼壁情況較普通培養(yǎng)基差，仍需進一步研究并尋找一種更為優(yōu)良的貼壁方法。

綜上所述，改良型生物硅膠膜對NSCs的生長、增殖及誘導分化無明顯影響，但能促進細胞之間突起的增長，可作為培養(yǎng)載體用于研究力學因素對NSCs增殖、誘導分化的影響。

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