李 友，廖 鋒，崔理立，馬國達(dá)，李克深

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院衰老與心腦疾病相關(guān)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨神經(jīng)病學(xué)研究所，廣東湛江524001)

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病，其發(fā)病率、致殘率及病死率均高，其中缺血性腦卒中占80%以上［1］。遺傳因素和環(huán)境因素共同參與腦卒中的發(fā)生。由腦內(nèi)小血管閉塞導(dǎo)致的腔隙性腦梗死是腦卒中最常見的一種類型，其與腦內(nèi)大中血管閉塞所致大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(ACI)可能存在不同的遺傳學(xué)機(jī)制。盡管腔隙性腦梗死病變面積不大，仍可造成嚴(yán)重功能障礙，并可能是血管性癡呆的病因。去整合素金屬蛋白酶(ADAMs)家族為Ⅰ型跨膜蛋白，參與細(xì)胞增殖分化及胞外基質(zhì)重建、血管形成、細(xì)胞遷移等，與炎癥、惡性腫瘤、阿爾茨海默病(AD)及動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的病理過程相關(guān)［2］。ADAM10是ADAM家族的重要成員，越來越多的證據(jù)表明其可能在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中起重要作用［3］。ADAM10基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性可調(diào)節(jié)其表達(dá)［4］，且已被證實(shí)與AD及行為紊亂等疾病相關(guān)［5，6］。目前，國內(nèi)外有關(guān) ADAM10多態(tài)性與腔隙性腦梗死的相關(guān)報(bào)道鮮見。本研究采用病例對(duì)照方法分析了ADAM10基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與腔隙性腦梗死的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對(duì)象為2011年2月～2012年9月于我院神經(jīng)內(nèi)科診治的173例腔隙性腦梗死患者(梗死組)，男117例，女56例;年齡(69.89± 9.78)歲，其中≥70歲96例、＜70歲77例。均符合全國第四屆腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT/MRI檢查證實(shí)，梗死灶直徑均＜15 mm。對(duì)照組為297例性別及年齡匹配的本院非心腦血管疾病門診體檢者，男192例，女105例;年齡(69.67± 8.63)歲，其中≥70歲151例、＜70歲146例。剔除標(biāo)準(zhǔn):伴房顫、血液病、結(jié)核、惡性腫瘤、大動(dòng)脈炎、周圍血管疾病、周圍血管栓塞性疾病及嚴(yán)重肝腎功能不全者。該研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均被告知研究目的，并簽署知情同意書。

1.2 基本資料收集及檢測(cè) 通過問卷訪談收集兩組吸煙史、高血壓史、糖尿病史，采用自動(dòng)化酶標(biāo)儀測(cè)定血糖、血脂水平。

1.3 ADAM10基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1 血液標(biāo)本采集及基因組DNA提取 兩組均禁食12～14 h，抽取清晨空腹外周靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝后-20℃保存。取全血0.5 mL，按照北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒的說明提取基因組DNA，-20℃保存。

1.3.2 基因型檢測(cè) 采用Snapshot法。選擇已報(bào)道的ADAM10啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)位點(diǎn) rs653765和rs514049［11］，在上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行基因型檢測(cè)。用于多重PCR擴(kuò)增的引物以Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)合成，具體序列:rs653765正義鏈為AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反義鏈為TGCATTTATGTTCGCATCACTGG;rs514049正義鏈為AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反義鏈為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAGAAAAAAAACCTCTGTTACTTGTGAC。PCR反應(yīng)體系為20μL:10×HotStarTaq buffer 2.0μL，3.0 mmol/L的Mg2+4.0μL，上下游引物分別為20 pmol，0.3 mmol/L的dNTP 0.5 mmol，HotStarTaq polymerase 1.0 U，樣本DNA 0.2～0.5 μg及滅菌去離子水適量，應(yīng)用自動(dòng)循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增條件:95℃2 min;94℃20 s，65℃40 s，72℃90 s，11個(gè)循環(huán);94℃20 s，59℃30 s，72℃90 s，24個(gè)循環(huán);72℃2 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物純化:在15μL的PCR產(chǎn)物中加入5 U蝦堿酶(SAP)和2 U ExonucleaseⅠ酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min?；蛐蜋z測(cè):①延伸產(chǎn)物(10μL)與1 U的SAP混合后于37℃孵育1 h，75℃滅活15 min;②取純化后的產(chǎn)物0.5μL、9μL的 Hi-Di及0.5μL的Liz120混勻，95℃變性 5 min;③上樣于ABI3130XL測(cè)序儀中，使用GeneMapper v4.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)測(cè)量 采用B型彩色多普勒超聲儀，探頭中性頻率為10 MHz。測(cè)量管腔與血管內(nèi)膜交界面到血管中膜與外膜交界面之間的垂直距離(取不同位點(diǎn)最大值)，分別測(cè)量兩側(cè)頸總動(dòng)脈前后壁值后取其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用HWE程序檢測(cè)Hardy-Weinberg平衡;基因型及等位基因頻率均使用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行分析;用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析;用方差分析評(píng)價(jià)ADAM10不同基因型與腔隙性腦梗死之間的關(guān)系;用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析ADAM10基因多態(tài)性與CIMT的關(guān)系。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較 梗死組吸煙史、高血壓史比例及血糖水平均顯著高于對(duì)照組(P均＜0.01)，高密度脂蛋白(HDL)和總膽固醇水平均顯著低于對(duì)照組(P均＜0.01);兩組甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)水平無顯著差異(P均＞0.05)。

2.2 兩組ADAM10基因啟動(dòng)子區(qū)多因型及等位基因頻率比較 兩組 ADAM10基因 rs653765和rs514049位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡，可進(jìn)行候選基因的關(guān)聯(lián)分析。梗死組ADAM10基因rs653765位點(diǎn)CC基因型頻率顯著低于對(duì)照組(P=0.008 0)、隱性模型CT+TT基因型頻率顯著高于對(duì)照組(OR=0.54，95%CI為0.36～0.81，P=0.002 9)，T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(OR=1.95，95%CI為1.37～2.79，P=0.000 2);兩組ADAM10基因rs653765位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率無顯著差異(P＞0.05)。詳見表1、2。

表1 兩組ADAM 10基因rs653765位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較(%)

表2 兩組ADAM 10基因rs514049位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較(%)

2.3 ADAM10基因多態(tài)性與不同性別人群腔隙性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 梗死組和對(duì)照組男性隱性模型ADAM10基因rs653765位點(diǎn)CT+TT基因型頻率分別為40.17%(47/173)、28.65%(55/297)，P =0.037(OR=0.60，95%CI為0.37～0.97)，T等位基因的頻率分別為22.22%(52/173)、15.89% (61/297)，P=0.048(OR=1.51，95%CI為1.00～2.28)。ADAM10基因rs514049位點(diǎn)的多態(tài)性在兩組男性與女性中均未見顯著差異(P＞0.05)。

2.4 ADAM10基因多態(tài)性與不同年齡人群腔隙性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 梗死組和對(duì)照組≥70歲者ADAM10基因rs653765位點(diǎn)CC基因型頻率分別為67.71%(65/173)、80.79%(122/297)，組間比較有顯著差異(P=0.041);隱性模型CT+TT基因型頻率分別為32.29%(31/173)、19.21%(29/ 297)，P=0.019(OR=0.50，95%CI為0.28～0.90);T等位基因頻率分別為17.19%(33/173)、10.93%(33/297)，P=0.046(OR=1.69，95%CI為1.00～2.85)。兩組ADAM10基因rs514049位點(diǎn)的多態(tài)性在≥70歲及＜70歲者中均未見顯著差異。

2.5 ADAM10基因多態(tài)性與梗死組CIMT的關(guān)系梗死組ADAM10基因rs653765位點(diǎn)基因型為CC及CT+TT者 CIMT分別為(0.135±0.047)、(0.127±0.028)cm，P=0.156;ADAM10基因rs514049位點(diǎn)基因型為AA及AC+CC者CIMT分別為(0.135±0.044)、(0.118±0.022)cm，P= 0.098。

3 討論

腔隙性腦梗死是腦梗死亞型之一，是發(fā)生于腦深穿通動(dòng)脈(或其他微小動(dòng)脈)的缺血性微梗死，近年來其發(fā)病率持續(xù)升高。以往研究認(rèn)為高血壓是誘發(fā)此病最主要的原因，但目前認(rèn)為除高血壓引起小動(dòng)脈壁脂質(zhì)玻璃樣變(玻璃樣變動(dòng)脈硬化)外，顱內(nèi)穿支動(dòng)脈粥樣硬化也是重要病因［7］。ADAMs家族為一個(gè)包含了三十多個(gè)成員的家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞—細(xì)胞和細(xì)胞—基質(zhì)的相互作用中至關(guān)重要。ADAM10為ADAM家族其中一員，其在許多與炎癥相關(guān)的血管細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞內(nèi)均有所表達(dá)［8］;許多與ADAM10有關(guān)的底物，如TNF-α、白介素 6受體(IL-6R)、趨化因子配體CX3CL1及L選擇素等，與脈管系統(tǒng)的發(fā)育、炎癥和再生過程有關(guān)，而這些過程均被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。近年來研究［9］證實(shí)，ADAM10可通過介導(dǎo)TNF-α、趨化因子配體CXCL16及CX3CL1、CD44等多種細(xì)胞因子和趨化因子胞外結(jié)構(gòu)域的脫落，參與血管生成、細(xì)胞遷移和反式遷移、黏附、炎癥等過程，最終影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

ADAM10基因多態(tài)性已在許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病中得到研究［6，10］。ADAM10基因 rs653765和rs514049位點(diǎn)的多態(tài)性被認(rèn)為可調(diào)節(jié)AD患者淀粉樣前體蛋白(APP)表達(dá)［4］。以往研究［11，12］顯示，ADAM10基因翻譯起始點(diǎn)上游-1～-2179 bp區(qū)域具有啟動(dòng)子活性，而其中的-300～-508 bp部分為其核心啟動(dòng)子區(qū)，而該啟動(dòng)子區(qū)內(nèi) rs653765與rs514049位點(diǎn)的多態(tài)性可影響AD患者的ADAM10和腦脊液中可溶性APPα水平表達(dá)，因而ADAM10基因rs653765位點(diǎn)C＞T多態(tài)性可能是一個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ADAM10基因rs653765的C＞T多態(tài)位點(diǎn)上游1個(gè)堿基處有潛在的myc基因相關(guān)鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(MAZ)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。本研究顯示，AD-AM10基因rs653765位點(diǎn)的多態(tài)性與腔隙性腦梗死的發(fā)病相關(guān)，且攜帶rs653765位點(diǎn)CT基因型或T等位基因的人群，其患腔隙性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。因此，ADAM10基因rs653765位點(diǎn)的C＞T多態(tài)性可能影響其與轉(zhuǎn)錄因子MAZ的結(jié)合，從而影響基因表達(dá)，而這些因素可能是潛在影響ADAM10基因多態(tài)性與腔隙性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的原因，但其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究針對(duì)性別和年齡亞組的研究發(fā)現(xiàn)，男性中攜帶ADAM10基因rs653765位點(diǎn)T等位基因者發(fā)生腔隙性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)比攜帶C等位基因者顯著升高，≥70歲人群中攜帶ADAM10基因rs653765位點(diǎn)CT基因型或T等位基因者患腔隙性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)較C等位基因者顯著升高。報(bào)道［13，14］顯示，男性腔隙性腦梗死發(fā)病率較女性高?？赡茉?女性體內(nèi)的雌性激素有利于膽固醇及脂蛋白代謝;人體內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞老化的自由基酶的基因定位于X染色體，故男性抗自由基損傷的能力比女性弱;男性更容易暴露于吸煙、飲酒等其他危險(xiǎn)因素中，各危險(xiǎn)因素之間相互疊加、相互作用［15］。CIMT增厚是動(dòng)脈粥樣硬化早期表現(xiàn)形式的一種［16］，主要由炎癥等作用于動(dòng)脈血管內(nèi)壁，促使彈性纖維和膠原纖維等成分過度降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)積聚和血管重塑引起;因與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展及腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，被認(rèn)為是腦梗死的強(qiáng)效預(yù)測(cè)因子［17］。本研究顯示，ADAM10基因rs653765和rs514049位點(diǎn)的多態(tài)性與腔隙性腦梗死患者CIMT無明顯相關(guān)。可能原因?yàn)橐訡IMT變化為表現(xiàn)形式的動(dòng)脈粥樣硬化早期病變中血管重塑并不明顯。此外，盡管CIMT增厚、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及腦梗死具有很多共同的危險(xiǎn)因素，但這三者均為眾多因素參與且互相影響而產(chǎn)生的不同病理現(xiàn)象。因此，以后需要對(duì)更大量的樣本進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步探究ADAM10基因多態(tài)性對(duì)CIMT的影響。

綜上所述，ADAM10基因rs653765位點(diǎn)T等位基因可能與腔隙性腦梗死的發(fā)病有關(guān)。

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