秦躍紅，王功朝，劉 濱，許尚臣，欒立明，龐 琦

(山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院，濟(jì)南250021)

新生血管的生成在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用，而多種血管生成因子在腫瘤新生血管生成中起重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族是目前研究最多，被認(rèn)為是起主要作用且作用最強(qiáng)的一種血管生長(zhǎng)因子［1，2］，VEGF-A和VEGF-C是該家族中的重要成員。本研究在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)了不同WHO分級(jí)星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A和VEGF-C的蛋白、mRNA表達(dá)，同時(shí)通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了腫瘤組織中微血管密度(MVD)，旨在為星形細(xì)胞腫瘤的靶向治療及預(yù)后判定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2007年12月～2010年6月在山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科行首次手術(shù)切除的星形細(xì)胞腫瘤患者92例，男52例，女40例;年齡(38.33± 13.06)歲。手術(shù)留取星形細(xì)胞腫瘤組織標(biāo)本，均經(jīng)病理檢查證實(shí)診斷，按WHO2000中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ級(jí)27例、Ⅲ級(jí)30例、Ⅳ級(jí)35例。另取9例接受高血壓腦出血開顱手術(shù)患者的正常腦組織(均經(jīng)知情同意)作為對(duì)照。

1.2 主要試劑 兔抗人VEGF-C單克隆抗體、兔抗人VEGF-A單克隆抗體和兔抗人CD34單克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，免疫組織化學(xué)(SP法)山羊抗兔二抗試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司。TRIzol試劑盒、RT-PCR試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品。VEGF-A和VEGF-C引物根據(jù)GenBank中的相應(yīng)序列，均由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成，VEGF-A引物: 5＇-GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTAC-3＇，下游為:5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，擴(kuò)增片段為148 bp; VEGF-C引物:上游為5＇-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-3＇，下游為5＇-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3＇，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為93 bp;β-actin引物:上游為5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下游為5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3＇，擴(kuò)增片段為186 bp。

1.2 VEGF-A、VEGF-C蛋白和CD34(MVD)檢測(cè) 分別取兩種腦組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)(SP)法檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知甲狀腺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)，VEGF-A、VEGF-C蛋白陽(yáng)性信號(hào)為胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒、無(wú)背景著色。CD34抗體可將血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色，高倍鏡下(×400倍)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)微血管數(shù)量，其平均值即為MVD。

1.3 VEGF-A、VEGF-CmRNA檢測(cè) ①總RNA抽提和cDNA合成:分別取星形細(xì)胞腫瘤和正常腦組織標(biāo)本各100 mg，參照TRIzol試劑產(chǎn)品說明書提取總RNA。紫外分光光度計(jì)下測(cè)得260、280 nm處的吸光度(其比值均在1.8～2.0)。參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書用oligo DT逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。②RT-PCR擴(kuò)增:根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，內(nèi)參為β-actin。針對(duì)各靶基因的引物根據(jù)GenBank中的相應(yīng)序列，由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。目的基因數(shù)量用相對(duì)定量表示，內(nèi)參基因β-actin的數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。先分別獲得各組織目的基因、內(nèi)參基因的CT值，ΔCT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值，ΔΔCT=腫瘤組織ΔCT-正常腦組織ΔCT。腫瘤組織目的基因相對(duì)應(yīng)于正常腦組織目的基因的量用2-ΔΔCT計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。VEGF-A、VEGF-C蛋白表達(dá)與MVD的關(guān)系進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，在正常腦組織和不同WHO分級(jí)星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn);VEGF-A、VEGF-CmRNA在不同WHO分級(jí)星形細(xì)胞腫瘤間及正常腦組織中的表達(dá)差異進(jìn)行單因素方差分析; VEGF-A和VEGF-C表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行直線相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-A、VEGF-C蛋白表達(dá)和MVD 星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及MVD均顯著高于正常腦組織，且均隨腫瘤惡性程度增高而增大(P均＜0.01);腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C蛋白表達(dá)及兩者與MVD均呈顯著相關(guān)(P均＜0.01)。詳見表1。

表1 不同腦組織VEGF-A蛋白、VEGF-C蛋白、MVD比較

2.2 星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C mRNA的表達(dá) 星形細(xì)胞腫瘤組織中 VEGF-A和 VEGF-CmRNA表達(dá)均顯著高于正常腦組織，且均隨腫瘤惡性程度增高而增強(qiáng)(P均＜0.05);腫瘤組織中VEGF-A和VEGF-CmRNA相對(duì)表達(dá)呈顯著相關(guān)(P均＜0.05)。詳見表2。

表2 星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C m RNA的表達(dá)比較(±s)

表2 星形細(xì)胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C m RNA的表達(dá)比較(±s)

星形細(xì)胞腫瘤組織VEGF-A mRNA VEGF-CmRNA WHOⅡ級(jí) 1.82±0.59 1.71±0.53 WHOⅢ級(jí) 2.94±0.82 3.05±0.78 WHOⅣ級(jí)3.37±0.96 3.35±0.94

3 討論

星形細(xì)胞腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見和難治愈的原發(fā)性上皮腫瘤［3］，WHO2000分類標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)腫瘤惡性程度將其分為4級(jí)，其中Ⅱ級(jí)為低度惡性腫瘤(星形細(xì)胞瘤)、Ⅲ級(jí)(間變性星形細(xì)胞瘤)及Ⅳ級(jí)(多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)為高度惡性腫瘤［4］。星形細(xì)胞瘤雖為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，但因?yàn)槟[瘤有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)特性，難以做到全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度極高，約占所有腦原發(fā)腫瘤的30%及膠質(zhì)瘤的50%，腫瘤細(xì)胞常與周邊正常腦組織混雜生長(zhǎng)，采取術(shù)后放化療者生存時(shí)間一般僅為3個(gè)月～2 a［5］。因此，明確星形細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)制，并針對(duì)性地采取新型生物性治療，有可能延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間、降低復(fù)發(fā)率。

血管生成與多種腫瘤如乳腺組織、腦組織和胃組織等惡性腫瘤的預(yù)后、復(fù)發(fā)顯著相關(guān)［6，7］。血管生成因子在新生血管生成過程中起核心作用，已知的重要成員包括VEGF家族、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族和纖維生成因子家族等，其中VEGF家族是研究最為廣泛和深入的一支，包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長(zhǎng)因子等。VEGF-A是已知VEGF家族中作用最強(qiáng)的成員［8］，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)新生血管的生成［9］。VEGF-A受體抑制劑目前已應(yīng)用于臨床，并被證實(shí)可延長(zhǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和其他實(shí)質(zhì)性腫瘤患者的生存時(shí)間，改善患者的生存質(zhì)量［10］。但是，VEGF-A靶向治療仍無(wú)法完全抑制膠質(zhì)瘤的血管生成，阻止膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。VEGF-C以往被認(rèn)為僅與腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但新近研究［11］顯示其還可促進(jìn)微血管形成、間接促進(jìn)腫瘤血行轉(zhuǎn)移，縮短患者生存時(shí)間和降低生存率。多項(xiàng)研究證實(shí)，VEGF-A和VEGF-C在多種癌組織中存在共表達(dá)。Aliparasti等［12］發(fā)現(xiàn)急性淋巴性白血病細(xì)胞中VEGF-A和VEGF-C表達(dá)存在顯著相關(guān)，Salajegheh等［13］通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR技術(shù)在甲狀腺癌組織中得出相似結(jié)論。本研究顯示，星形細(xì)胞腫瘤組織及正常腦組織中VEGF-A、VEGF-C表達(dá)有顯著差異，且兩者間的表達(dá)及與腫瘤WHO分級(jí)、MVD之間均呈顯著正相關(guān)。提示隨星形細(xì)胞腫瘤惡性程度增高，腫瘤細(xì)胞病理性分裂增殖活動(dòng)及代謝加快，原有血管已不能滿足腫瘤組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求;VEGF-A、VEGF-C可能通過共同促進(jìn)病理性新生血管生成參與星形細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制尚待深入研究。

綜上所述，VEGF-A、VEGF-C在星形細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)并與腫瘤惡性程度有關(guān)，兩者間及與腫瘤血管生成均呈顯著相關(guān)，此為星形細(xì)胞腫瘤的靶向治療及預(yù)后判定提供了新思路。

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