張 寧，田錫煒，王永紅，儲(chǔ) 炬，張嗣良

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

乳酸廣泛應(yīng)用于食品、制藥、皮革、紡織工業(yè)以及化工原料方面，其最有前景的是用于合成可生物降解和具有生物相容性的聚合物，聚乳酸（PLA）[1]?；谌樗嵩诳沙掷m(xù)資源方面的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的研究者將目光聚集在乳酸單體的生產(chǎn)上。近年來(lái)乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但是研究者們?nèi)灾铝τ趯で蠼?jīng)濟(jì)高效的發(fā)酵過(guò)程來(lái)生產(chǎn)乳酸[2-4]。

在影響乳酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程因素的研究報(bào)道中，底物及外界環(huán)境因素（如pH、通氣和攪拌等）被證明能夠影響乳酸菌的生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)。在多數(shù)有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程中，通常向發(fā)酵液中不斷補(bǔ)入堿性中和劑來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH在合適的范圍，從而有利于菌體生長(zhǎng)和生產(chǎn)。但是連續(xù)補(bǔ)入堿性中和劑會(huì)引起發(fā)酵液中環(huán)境滲透壓不斷升高，這嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸[5]。環(huán)境滲透壓的增加往往會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率和活性的降低并且影響細(xì)胞的代謝[6-10]。研究表明微生物本身具有多種滲透壓應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制來(lái)保護(hù)或減輕細(xì)胞受到的影響，這些機(jī)制包括自身合成可溶性溶質(zhì)和滲透壓保護(hù)劑[11-12]、代謝流的重新分布[13]以及細(xì)胞膜特性的改變[14-15]。海藻糖、甜菜堿以及脯氨酸通常作為滲透壓保護(hù)劑，用于降低發(fā)酵過(guò)程中滲透應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的影響。Andersson等[16]向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿來(lái)降低滲透應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的影響，使得發(fā)酵時(shí)間縮短了約32h。Xu等[17]報(bào)道了向培養(yǎng)基中添加1g/L脯氨酸后，細(xì)胞生長(zhǎng)和丙酮酸產(chǎn)率分別增加了59%和14.3%。Purvis等[18]驗(yàn)證了大腸桿菌過(guò)量表達(dá)海藻糖能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。工業(yè)菌株擬干酪乳酸桿菌在高糖及向發(fā)酵液中不斷補(bǔ)入堿性中和劑的發(fā)酵情況下，觀察到這些因素所造成的高滲透壓對(duì)擬干酪乳桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸產(chǎn)生了很強(qiáng)脅迫作用，為了降低滲透壓對(duì)發(fā)酵的影響，通過(guò)比較海藻糖、甜菜堿以及脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑，進(jìn)而選擇一種能夠在高糖及補(bǔ)加堿性中和劑的擬干酪乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中有效改善環(huán)境滲透壓的保護(hù)劑，從而改善擬干酪乳桿菌工業(yè)菌株的發(fā)酵應(yīng)用。

本文研究了滲透壓對(duì)于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響，并篩選了一種滲透壓保護(hù)劑來(lái)增加菌體的葡萄糖消耗速率及L-乳酸的產(chǎn)率。此外，通過(guò)分析胞外副產(chǎn)物的變化，討論了滲透壓保護(hù)劑對(duì)于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬干酪乳酸桿菌 本實(shí)驗(yàn)室保藏，保存方法為菌種種子液、水、甘油以1∶2∶1的比例保存于-80℃；葡萄糖 上?；菖d生化試劑有限公司，分析純；蛋白胨 化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站，生化試劑；牛肉膏 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，生化試劑；酵母膏 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生化試劑；其他試劑 來(lái)源于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

UV-VIS-752分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；SBA-40D生化分析儀 山東省科學(xué)院；5L玻璃發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；pH計(jì) 美國(guó)Mettler Toledo公司；分析天平 上海天平儀器；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司制造；FM-8P全自動(dòng)冰點(diǎn)滲透壓計(jì) 上海醫(yī)大儀器廠；安捷倫1100HPLC 美國(guó)安捷倫科技。

1.2 培養(yǎng)基

茄子瓶斜面培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏6，酵母浸提物10，磷酸氫二鉀2，檸檬酸二胺2，乙酸鈉4，葡萄糖40，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，瓊脂18，吐溫-80 1m L，碳酸鈣10，NaOH調(diào)pH 6.0，115℃滅菌20m in。

搖瓶種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，氯化鈉0.03，硫酸亞鐵0.01，乙酸鈉4，檸檬酸二胺2，磷酸氫二鉀2，吐溫-80 1m L，碳酸鈣25，NaOH調(diào)pH 6.0，115℃滅菌20m in。葡萄糖（40g/L）單獨(dú)分開(kāi)滅菌，115℃滅菌20m in。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨13.33，酵母膏13.33，硫酸鎂0.0133，硫酸錳0.0133，氯化鈉0.0133，硫酸亞鐵0.0133，醋酸鈉0.67，碳酸鈣40，NaOH調(diào)pH6.0，115℃滅菌2min。葡萄糖（90g/L）單獨(dú)分開(kāi)滅菌，115℃滅菌20m in。

5 L罐培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨13.33，酵母膏13.33，硫酸鎂0.0133，硫酸錳0.0133，氯化鈉0.0133，硫酸亞鐵0.0133，醋酸鈉0.67。115℃滅菌20m in。葡萄糖（200g/L）單獨(dú)分開(kāi)滅菌，115℃滅菌20m in。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 用水刮洗茄子平斜面后按15%的接種量接至搖瓶種子中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/m in，溫度為37℃。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的搖瓶種子按20%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為100r/m in，溫度為37℃。

1.3.3 5L罐批培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用5L攪拌式反應(yīng)器進(jìn)行批培養(yǎng)發(fā)酵，工作體積為4L。轉(zhuǎn)速，通氣和溫度分別為150r/m in，0.025vvm和37℃，發(fā)酵過(guò)程中適用25%氨水控制發(fā)酵液pH 6.0，接種量為20%。

1.3.4 發(fā)酵上清液的制取 取10m L發(fā)酵液5000r/m in 10m in離心得上清，將上清稀釋到合適濃度，檢測(cè)前過(guò)濾上清液。濾液用于檢測(cè)滲透壓、葡萄糖、L-乳酸及副產(chǎn)物。

1.3.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 生物量的測(cè)定 采用比濁法，在620nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。本文用OD620nm來(lái)表征細(xì)胞生物量。

1.3.5.2 發(fā)酵液中滲透壓、葡萄糖、L-乳酸及副產(chǎn)物的檢測(cè) 滲透壓：通過(guò)FM-8P Auto.F.P.滲透壓儀進(jìn)行檢測(cè)。

L-乳酸：通過(guò)SB-40C生物傳感分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

葡萄糖：通過(guò)葡萄糖試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

胞外副產(chǎn)物：包括丙酮酸、甲酸、乙酸以及乙偶姻通過(guò)HPLC（安捷倫1100，美國(guó)安捷倫科技）進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件：采用Metacarb H Plus柱（300mm×7.8mm；Varian Inc.，PaloA lto，CA，USA）進(jìn)行樣品分離。工作溫度為50℃，樣品用5mmol/L的H2SO4以0.4m L/m in進(jìn)行洗脫，并在210nm處UV檢測(cè)器儀進(jìn)行分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 滲透壓對(duì)于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響 向培養(yǎng)基中分別添加濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/L的NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，將細(xì)胞在含不同濃度的NaCl，初始葡萄糖為90g/L搖瓶?jī)?nèi)37℃培養(yǎng)24h來(lái)研究滲透壓對(duì)L.paracasei生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響。發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)測(cè)定乳酸量、殘?zhí)橇縼?lái)觀察滲透壓對(duì)L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響。

1.4.2 滲透壓保護(hù)劑的選擇 向培養(yǎng)基中添加1mol/L的NaCl來(lái)產(chǎn)生一定的滲透壓，為了降低L.paracasei發(fā)酵過(guò)程中的滲透壓，實(shí)驗(yàn)中比較了海藻糖、甜菜堿和脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑對(duì)乳酸發(fā)酵中滲透壓的影響。將菌體分別在初始葡萄糖濃度為90g/L左右、含指定濃度NaCl及指定濃度不同滲透壓保護(hù)劑的搖瓶?jī)?nèi)37℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)檢測(cè)乳酸、殘余葡萄糖、OD620nm來(lái)判斷最合適的滲透壓保護(hù)劑。

1.4.3 5L罐驗(yàn)證脯氨酸對(duì)于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用 本實(shí)驗(yàn)在5L攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行批發(fā)酵來(lái)驗(yàn)證脯氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)的作用。通過(guò)比較菌體在初始葡萄糖濃度200g/L，37℃培養(yǎng)，發(fā)酵24h后添加和未添加脯氨酸情況下菌體生長(zhǎng)、乳酸生產(chǎn)、葡萄糖消耗以及有機(jī)酸生產(chǎn)來(lái)驗(yàn)證脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑的有效性。

1.5 計(jì)算公式

乳酸平均生產(chǎn)速率（g/（L·h））=乳酸生成量（g/L）/發(fā)酵時(shí)間（h）；

葡萄糖平均消耗率（g/（L·h））=葡萄糖消耗量（g/L）/發(fā)酵時(shí)間（h）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文中所有數(shù)據(jù)均取自三組平行實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 滲透壓對(duì)于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響

本實(shí)驗(yàn)采用NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑來(lái)研究滲透壓對(duì)L.paracasei生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響（圖1）。同樣的發(fā)酵條件下，菌體生物量、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗量隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的增加而迅速下降。乳酸產(chǎn)率從2.78g（/L·h）降至0.31g（/L·h），葡萄糖消耗率從2.47g（/L·h）降至0.08g（/L·h）。當(dāng)NaCl濃度從0增加到1mol/L時(shí)，雖然菌體生物量大大下降，幅度達(dá)到39.8%，但是乳酸量?jī)H降低了12.2%。而當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度超過(guò)1mol/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成明顯被抑制了。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度為1.5mol/L時(shí)，細(xì)胞菌體及乳酸分別僅為NaCl 1mol/L時(shí)的53.9%和47.19%。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度為2mol/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)已經(jīng)終止，幾乎無(wú)乳酸產(chǎn)物形成。因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，選擇1mol/L NaCl作為滲透壓保護(hù)劑的篩選條件進(jìn)行研究。

圖1 滲透壓對(duì)L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響Fig.1 Influence of the osmotic stress on L-lactic acid production by L.paracasei

2.2 滲透壓保護(hù)劑的選擇

滲透壓保護(hù)劑是一種小分子，它有助于保持膜的完整性和蛋白的穩(wěn)定性，從而保證細(xì)胞能夠在極端滲透壓下存活。微生物可自身合成滲透壓保護(hù)劑或者從培養(yǎng)基中攝取[19-20]。發(fā)酵過(guò)程中常用的滲透壓保護(hù)劑有海藻糖、甜菜堿和脯氨酸。為了降低L.paracasei發(fā)酵過(guò)程中的滲透壓，本文比較了海藻糖、甜菜堿和脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑對(duì)乳酸發(fā)酵中滲透壓的影響。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)向培養(yǎng)基中添加1mol/L的NaCl來(lái)產(chǎn)生一定的滲透壓（表1）。

表1 添加不同濃度滲透壓保護(hù)劑的發(fā)酵結(jié)果Table1 Fermentation resultswith different concentrations of osmoprotectants

從表1可以看出，發(fā)酵24h后，加入1mol/L NaCl的實(shí)驗(yàn)組其細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗要明顯低于未加NaCl的對(duì)照組。同時(shí)滲透壓保護(hù)劑的加入能在一定程度上減輕對(duì)L.paracasei生長(zhǎng)和生產(chǎn)的影響，特別是脯氨酸和海藻糖，其作用要明顯優(yōu)于甜菜堿。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)高濃度（10、20g/L）的甜菜堿對(duì)于L.paracasei生長(zhǎng)和生產(chǎn)具有一定的抑制作用，這可能因?yàn)楸旧砀邼舛鹊奶鸩藟A也會(huì)產(chǎn)生一定程度的滲透壓，從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝造成影響。綜合考慮菌體生長(zhǎng)，乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗，在1mol/L的滲透應(yīng)激條件下，添加2g/L脯氨酸最有利于L.paracasei生長(zhǎng)和生產(chǎn)，其發(fā)酵24h后，菌體生物量、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗速率分別為未添加脯氨酸實(shí)驗(yàn)組的1.39、1.36、1.72倍。因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，選擇2g/L脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑進(jìn)行研究。

2.3 5L罐驗(yàn)證脯氨酸對(duì)于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用

本實(shí)驗(yàn)在5L攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行批發(fā)酵來(lái)驗(yàn)證脯氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)的作用（圖2）。圖2為初始葡萄糖濃度200g/L，發(fā)酵24h后添加和未添加脯氨酸情況下菌體生長(zhǎng)、乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗過(guò)程。

從圖2中可以看出，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可以根據(jù)產(chǎn)乳酸速率分為3個(gè)階段，分別為階段I（0～24h，產(chǎn)酸快速），階段II（24～35h，產(chǎn)酸較慢）和階段III（35～60h，產(chǎn)酸幾乎停滯）。因此選擇在24h后加入2g/L的脯氨酸，這是因?yàn)樵诖藭r(shí)產(chǎn)酸速率明顯減緩，同時(shí)在以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此時(shí)發(fā)酵液中滲透壓與上面所述搖瓶中加入1mol/L NaCl后的初始培養(yǎng)基滲透壓較為接近（數(shù)據(jù)未顯示）。在階段Ⅰ，由于實(shí)驗(yàn)組（24h加入脯氨酸）和對(duì)照組（24h未加脯氨酸）的發(fā)酵條件完全一致，因此菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸和耗糖都較為一致。當(dāng)進(jìn)入階段Ⅱ后，雖然菌體生物量沒(méi)有大的差異，但是添加了脯氨酸的實(shí)驗(yàn)組菌體的產(chǎn)酸和耗糖與對(duì)照組相比發(fā)生了明顯變化。在階段Ⅲ中，兩組的產(chǎn)酸都幾乎停滯，而且耗糖速率也大大降低，這可能是由于滲透壓到達(dá)了一定的高度，此時(shí)脯氨酸對(duì)于細(xì)胞的保護(hù)作用也已經(jīng)大大減弱。

圖2 添加脯氨酸和未添加脯氨酸條件下，L.paracasei在5L罐中細(xì)胞生長(zhǎng)，乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗對(duì)比Fig.2 Fermentation progresses of cell growth，L-lactic acid production and glucose consumption by L.paracasei in a 5L bioreactorwith orwithout proline addition

表2，可知階段Ⅱ中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)酸及耗糖的差異，該階段實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)酸速率為2.18g（/L·h），耗糖速率為3.56g（/L·h）；而對(duì)照組的產(chǎn)酸速率率為1.45g（/L·h），耗糖速率為2.55g（/L·h），分別增加了50.34%和39.61%。

表2 脯氨酸添加和未添加條件下，L.paracasei生理參數(shù)的比較（g/（L·h））Table2 Comparison of physiological parameters on L.paracasei with orwithout proline addition（g/（L·h））

此外，脯氨酸的加入對(duì)其他胞外副產(chǎn)物的形成也有影響。從表3中可以看出，發(fā)酵結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組中的丙酮酸、乙酸以及乙偶姻產(chǎn)量分別比對(duì)照組降低了42.3%、17.6%、38.8%，這可能是脯氨酸的加入有利于胞內(nèi)代謝流由副產(chǎn)物途徑流向乳酸途徑。

表3 脯氨酸添加和未添加條件下胞外副產(chǎn)物的比較Table3 Comparison of extracellular byproductswith or without proline addition

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，脯氨酸能夠在一定范圍內(nèi)有效調(diào)控細(xì)胞對(duì)環(huán)境滲透壓的應(yīng)激響應(yīng)，有利于菌體的產(chǎn)酸和耗糖。

3 結(jié)論

本文研究了環(huán)境滲透壓對(duì)于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響，結(jié)果表明菌體生長(zhǎng)和代謝隨著環(huán)境滲透壓的增加受到顯著抑制。通過(guò)篩選三種滲透壓保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)2g/L脯氨酸能夠有效緩解高環(huán)境滲透壓對(duì)于菌體的抑制。在5L罐批培養(yǎng)過(guò)程中，隨著脯氨酸的加入，乳酸產(chǎn)率和耗糖率分別比未添加脯氨酸的對(duì)照組增加了50.34%和39.61%。同時(shí)胞外主要副產(chǎn)物的對(duì)比分析表明脯氨酸的添加能夠一定程度上改變代謝流由副產(chǎn)物途徑流向乳酸途徑。本文通過(guò)添加滲透壓保護(hù)劑提高了乳酸的生產(chǎn)，進(jìn)而也對(duì)于其他有機(jī)酸發(fā)酵具有重要的借鑒意義。

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