馬超　馮世慶　班德翔　劉洋　高仕杰

【摘要】 目的：探討大鼠脊髓組織星形膠質細胞體外培養(yǎng)、純化和鑒定的方法。方法：于無菌條件下取新生1～2 d的SD大鼠脊髓組織，采用機械吹打及胰酶消化法制成細胞懸液，通過差速貼壁和恒溫搖床震蕩去除雜細胞，進行培養(yǎng)。用膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫細胞化學染色對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。結果：分離培養(yǎng)的細胞具有典型的星形膠質細胞的形態(tài)，傳至第3代細胞純度達95%以上。結論：成功建立了大鼠脊髓星形膠質細胞體外培養(yǎng)方法，為脊髓星形膠質細胞的實驗研究奠定基礎。

【關鍵詞】 星形膠質細胞； 脊髓； 細胞培養(yǎng)； 大鼠

膠質細胞是神經系統(tǒng)內數(shù)量眾多的一大類細胞群體，約占中樞神經系統(tǒng)細胞的90%以上，而星形膠質細胞是其中最主要的組成成分之一，在調控神經元微環(huán)境、誘導神經細胞遷移、維持神經組織形態(tài)、提供神經營養(yǎng)因子及輔助完善突觸聯(lián)系等方面均發(fā)揮著重要功能[1]。體外培養(yǎng)是研究星形膠質細胞形態(tài)、功能及神經生物學和神經藥物學的重要手段，但以往的取材以大腦皮質為主，脊髓相對較少[2-4]。本研究參照國內外培養(yǎng)分離星形膠質細胞的方法，擬建立脊髓源性星形膠質細胞的體外分離、培養(yǎng)、純化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生1～2 d的SD大鼠，由天津醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雌雄不限。

1.1.2 主要設備及試劑 CO2 培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），200目濾網、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗，EDTA-0.25%胰酶，D-Hanks液（北京索萊寶公司），兔抗大鼠膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體，TRITC標記羊抗兔免疫球蛋白（武漢博士德生物有限公司），倒置相差顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）[2]。

1.2 實驗方法

1.2.1 脊髓組織星形膠質細胞的原代培養(yǎng) 新生1～2 d的SD大鼠腹腔麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5～10 min，眼科剪沿大鼠后背正中剪開，眼科彎鑷輕輕鈍性分離脊柱兩旁組織，顯露視野，然后在超凈臺上取脊髓組織，放入D-Hanks液漂洗3次后剪碎，置于0.25%的EDTA-胰蛋白酶中并用吹管輕輕吹打15～20次，37 ℃消化10 min。立即用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化[3-4]。再次用吸管輕輕吹打15～20次制成細胞懸液，以200目不銹鋼濾網過濾，濾液轉移至10 mL離心管，1300 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吸管吹打重懸，制成的細胞懸液接種于已包被左旋多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min進行差速黏附處理[5]。取出培養(yǎng)瓶，輕輕翻轉，吸取細胞懸液，倒置相差顯微鏡下臺盼藍染色計數(shù)，按1×106/mL接種于另一已包被左旋多聚賴氨酸培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d，次日37 ℃恒溫搖床280～300 r/min水平振蕩16～18 h后，倒掉培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基漂洗2次后，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3～4 d換液，直到細胞即將鋪滿瓶底融合，進行消化傳代[6]。

1.2.2 脊髓組織星形膠質細胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的細胞即將融合鋪滿瓶底時，吸去舊培養(yǎng)基，用D-Hanks液洗滌2次，加入適量0.25%的EDTA-胰蛋白酶，以覆蓋細胞為準，消化8～10 min，待細胞回縮變圓并約有30%～50%懸浮在消化液時，立即用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化反應，然后用吸管反復吹打培養(yǎng)瓶底部，使細胞從瓶壁上脫落。然后將細胞懸濁液轉移至10 mL離心管，1300 r/min離心5 min，棄上清液，加入少量含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，倒置相差顯微鏡下臺盼藍染色計數(shù)，按2×104/mL密度接種在預先包被左旋多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d或細胞鋪滿瓶底將要融合時再進行傳代。

1.2.3 脊髓星形膠質細胞的鑒定 細胞培養(yǎng)瓶每日置于倒置相差顯微鏡下，觀察細胞胞體、突起形態(tài)及生長情況。將每次傳代的少量細胞以1×105/mL的密度接種于放入事先用左旋多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板內，培養(yǎng)2 d后，吸去6孔板內的細胞培養(yǎng)液，加入PBS漂洗5 min×3次；加入4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS漂洗5 min×3 min，行GFAP免疫細胞化學顯色。兔抗GFAP多克隆抗體（1：50）4 ℃冰箱過夜。第2天復溫20 min，PBS漂洗5 min×3次，避光，加TRITC標記的羊抗兔IgG（1：100），37 ℃孵育1 h。DAPI復染5 min，PBS漂洗5 min×3次，熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照計數(shù)。

2 結果

2.1 星形膠質細胞的原代培養(yǎng)結果 剛接種的細胞在倒置相差顯微鏡下觀察，呈圓形，折光性強，懸浮于培養(yǎng)基中；24 h后大部分細胞已貼壁，但表面仍有少許細胞漂?。唤?6～18 h的恒溫搖床振蕩，換液后溶液中無漂浮細胞，貼壁部分細胞伸出細小突起；培養(yǎng)3～4 d后，細胞數(shù)量明顯增多，長出突起的細胞明顯增多比例越來越大，而神經元、少突膠質細胞等其他細胞所占比例越來越少。一般培養(yǎng)8～10 d細胞即將鋪滿瓶底融合成片。

2.2 星形膠質細胞的傳代培養(yǎng)結果 所培養(yǎng)的細胞即將鋪滿瓶底達到完全融合時，進行第1次傳代培養(yǎng)，傳代后細胞生長活躍，12 h即可貼壁，3～5 d細胞就可鋪滿瓶底。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)不規(guī)則，突起較多較長，細胞核多位于胞體的一側，以橢圓形較為常見；胞漿豐富，密度較低，核/漿比較小。

2.3 星形膠質細胞的鑒定 膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質細胞胞漿中的骨架蛋白，為其特異性標志蛋白[7]。培養(yǎng)的細胞每次傳代應用兔抗GFAP多克隆抗體免疫細胞化學染色法進行鑒定，細胞核為藍色熒光，陽性細胞胞體為紅色熒光。統(tǒng)計結果顯示第3次傳代陽性率分別達到95%以上，絕大多數(shù)細胞為星形膠質細胞。endprint