李雙星,樸豐源,戚 媛,劉曉輝,李亞晨,劉 爽,李雙月
(1哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,哈爾濱150001;2大連醫(yī)科大學)
骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類來源于中胚層、具有多向分化潛能的成體干細胞,可向骨、神經、肝、心肌、內皮等多種胚層細胞分化,已經成為組織工程和細胞移植的重要細胞來源,在組織功能/結構重建、創(chuàng)傷修復及人工器官等領域具有廣闊的應用前景[1,2]。有關BMSCs的研究目前多集中于人、大鼠和小鼠,雞BMSCs相關的研究報道不多見。雞作為首個進行基因組測序的禽類,已揭示了眾多胚胎發(fā)育機制,動物腫瘤可由病毒引起亦是以雞為模型首次證明,雞是胚胎發(fā)育、腫瘤和免疫系統(tǒng)等研究的重要模型,雞BMSCs已成為相關研究不可替代的體外模型[3~5]。2009年,Mahesh等首次分離培養(yǎng)出雞BM-SCs,但其采用的密度梯度離心法操作繁瑣,同時亦破壞了BMSCs的生長微環(huán)境,限制了BMSCs的培養(yǎng)和應用[6,7]。2012年11月~2013年5月,我們利用全骨髓貼壁法對雞BMSCs進行分離培養(yǎng)和鑒定,以期建立一種簡單、高效的雞BMSCs分離、培養(yǎng)體系,為雞BMSCs的進一步研究和應用提供實驗基礎。
1.1 材料 羅曼鶴雞,1~14天齡,由大連韓偉集團提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司),二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、青霉素、鏈霉素(上海生工生物工程有限公司),地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、谷氨酰胺、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤、吲哚美辛(Sigma公司),FITC-CD29抗體、PE-CD34抗體(e-Bioscience公司)。
1.2 雞BMSCs的分離培養(yǎng) 雞脫臼處死,無菌分離完整的股骨及脛骨,清除附著的肌肉組織,暴露骨髓腔并反復沖洗,尤其是干骺端。將沖出的骨髓細胞過篩網制成單細胞懸液,離心后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸并接種于培養(yǎng)皿,于37℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后全量換液,以后每3 d換液1次。待細胞達到80%~90%融合,0.25%胰酶消化并按1∶2進行傳代,利用差速貼壁特性逐步純化BMSCs。
1.3 雞BMSCs的鑒定
1.3.1 形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及貼壁狀況,并記錄。
1.3.2 增殖能力檢測 取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs,以4×103/mL接種于96孔板,每組6復孔,每3 d換液1次,采用MTT法檢測其生長增殖能力。從培養(yǎng)第1天到第7天,每天相應復孔加入20μL MTT(5 g/L)溶液,37℃孵育4 h,小心棄去上清液,每孔加入150μL DMSO,微量振蕩器震蕩10 min,使結晶物充分溶解,酶標儀檢測490 nm波長處各孔光密度值(OD值),以時間為橫坐標,OD值為縱坐標繪制生長曲線。
1.3.3 表面標志物檢測 第3代BMSCs胰蛋白酶室溫消化,離心收集細胞,PBS清洗細胞并制成單細胞懸液。各樣本分別加入抗CD29和CD34的熒光標記抗體,同時設立同型陰性對照,4℃避光孵育,用流式細胞儀進行檢測。
1.4 雞BMSCs分化能力檢測
1.4.1 雞BMSCs成骨誘導分化 將2×108/L生長狀況良好的第3代BMSCs接種于培養(yǎng)板,待細胞長至80%~90%融合時,在各誘導孔加入成骨誘導培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清、5μg/mL抗壞血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松),對照孔加入含10%胎牛血清的DMEM常規(guī)完全培養(yǎng)液,每3天換液1次。誘導分化第21天進行茜素紅染色。
1.4.2 雞BMSCs成脂誘導分化 選用第3代生長狀態(tài)良好的 BMSCs,2×108/L接種,待細胞長至80%~90%融合時,在各誘導孔加入成脂誘導培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清、5μg/mL胰島素、1μmol/L地塞米松、10 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、600 nmol/L吲哚美辛),對照孔加入DMEM常規(guī)完全培養(yǎng)液,每3天換液1次。誘導分化第14天進行油紅O染色。
2.1 雞BMSCs形態(tài)學變化 雞骨髓細胞初始接種時懸浮于培養(yǎng)液中,24 h后部分細胞貼壁,呈短梭形、多角形等形態(tài);6 d后部分細胞形成散在集落,細胞突起變長、變大,并且長短不一、粗細不均(圖1A);14 d左右細胞集落相互靠近并融合成片(圖1B)。傳代后細胞生長速度明顯變快,細胞形態(tài)趨向均一,長梭形、束狀或漩渦狀排列(圖1C)。
圖1 雞BMSCs的形態(tài)學變化
2.2 雞BMSCs生長曲線 見圖2。由圖2可見,雞BMSCs的生長潛伏期為1~3 d,之后進入對數生長期,第6天以后開始進入平臺期。
圖2 第3代雞BMSCs生長曲線
2.3 雞BMSCs表面標志物 流式檢測結果顯示,BMSCs的表面標志物 CD29的陽性表達率為92.10%,造血系細胞的表面標志CD34表達率僅為0.80%(圖3),提示第3代貼壁細胞主要是BMSCs。
2.4 雞BMSCs成骨誘導分化情況 成骨誘導第7天可見部分細胞聚集成團、呈放射狀排列,10 d左右出現細胞聚集形成的結節(jié),之后結節(jié)逐漸增多,部分細胞輪廓不清、透光性差。雞BMSCs誘導分化進行第21天茜素紅染色,陽性區(qū)域呈現鮮紅色,有明顯的礦化結節(jié)形成,見圖4。對照孔內未見著色區(qū)域。
圖3 雞BMSCs表面標志物表達情況
圖4 雞BMSCs來源的成骨細胞茜素紅染色(×200)
2.5 雞BMSCs成脂誘導分化情況 BMSCs成脂誘導14 d后,細胞密度減低,細胞間空隙增大,可見圓形高亮細胞,有些橢圓形細胞內可見呈串珠樣排列分布的脂樣小滴,脂滴變大并合并呈串珠狀。油紅O染色顯示胞質內有大量鮮紅色串珠樣或大的融合脂滴,細胞體積較大呈圓形(圖5)。對照細胞染色無脂質沉積。
圖5 雞BMSCs來源的成脂細胞油紅O染色(×100)
雞胚是發(fā)育生物學、腫瘤學、血管藥理學等研究的理想模型,成年雞更是遲發(fā)性神經毒性等研究不可替代的動物模型。而有關BMSCs的研究目前多集中于人和嚙齒類動物,家禽中多集中于豬,雞BMSCs的相關報道較少。本研究利用差速貼壁法,從羅曼鶴雞的骨髓中分離培養(yǎng)出高純度、高分化潛能的BMSCs。
目前,BMSCs體外分離培養(yǎng)體系主要包括密度梯度離心法、流式細胞儀分選法、免疫磁珠法、全骨髓貼壁法。密度梯度離心法可根據細胞密度的不同提取出單核細胞進行培養(yǎng),但操作較繁瑣、細胞獲得量較低。流式細胞術和免疫磁珠法雖可獲得純度較高的BMSCs,但對細胞活性有較大損傷,且價格昂貴,難以普及[8]。差速貼壁培養(yǎng)法是根據BMSCs的貼壁特性,通過定期換液去除骨髓中的不貼壁細胞的分離方法。此種方法篩選出的BMSCs活性高,損傷小,而且骨髓中的其他干細胞和基質細胞能分泌生長因子和細胞外基質,模擬體內微環(huán)境,促進BMSCs貼壁生長,BMSCs能較快適應體外培養(yǎng)環(huán)境,細胞增殖迅速[9]。要獲得較大數量、活性較高的BMSCs,全骨髓貼壁法更為可取。
各種屬來源的BMSCs目前均缺乏特異性的檢測指標,通常根據細胞形態(tài)、細胞增殖特點、相對特異的表面標記和多向分化潛能等方面相結合來對其進行鑒定,雞BMSCs亦是如此。本實驗羅曼鶴雞骨髓中分離的單個核細胞,通過差速貼壁篩選能夠生長形成長梭形或成纖維細胞樣、呈束裝或旋渦狀排列的細胞克隆,與間充質干細胞的形態(tài)學特征一致[10]。細胞生長曲線是判斷細胞活性的重要指標。細胞傳代后,一般先是短暫的懸浮然后貼壁,隨后度過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的對數生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生長,進入平頂期,然后退化衰亡。本研究用MTT法檢測并繪制了第3代雞BMSCs的生長曲線,經過3~6 d的對數生長期后進入平臺期。田少囡等[11]報道,北京油雞肺間充質干細胞在最佳培養(yǎng)體系內對數生長期可持續(xù)約4 d,品系及組織來源可能會影響間充質干細胞的細胞活性。高健等[12]報道,家禽中豬BMSCs的細胞活性也受品系影響,進一步證實了本實驗結果。
BMSCs目前缺乏特異性的表面標記物,一般認為CD29、CD90、CD105等都可作為BMSCs的重要標記物,而CD34、CD45等為造血系細胞的表面標志物,在BMSCs上不表達[13~16]。本實驗參考相關文獻報道,選擇CD29和CD34作為甄別BMSCs的標記物。結果證明,本研究得到了純度較高的BMSCs。
判定BMSCs的另一個重要指標是看其是否具有多向分化能力。分離的雞BMSCs向成骨細胞分化21 d后,細胞出現明顯的鈣化結節(jié),茜素紅染色陽性,顯示細胞分化為成骨細胞并有分泌鈣質的功能。雞BMSCs向脂肪細胞分化14 d后,細胞油紅O染色陽性,細胞內出現明顯的脂質小滴,證明細胞已向成脂細胞分化。
總之,本實驗成功分離培養(yǎng)出羅曼鶴雞BMSCs并進行了相關鑒定,建立了適合雞BMSCs的體外培養(yǎng)和鑒定體系,為進一步深入研究提供了實驗基礎。
[1]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,etal.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284 (5411):143-147.
[2]Herzog EL,Chai L,Krause DS,etal.Plasticity ofmarrow-derived stem cells[J].Blood,2003,102(10):3483-3493.
[3]Cooper MD,Raymond DA,Peterson RD,et al.The functions of the thymus system and the bursa system in the chicken[J].JExp Med,1966,123(1):75-102.
[4]Silveira P,Marin SY,Moreira PA,etal.Interactions of plasmodium juxtanucleare and chicken anaemia virus:establishing amodel[J].Parasitology,2013,140(14):1777-1788.
[5]Wang JX,Zhou JY,Yang QW,et al.An improved embryonated chicken eggmodel for the evaluation of antiviral drugs against influenza a virus[J].JVirol Methods,2008,153(2):218-222.
[6]KhatriM,O'Brien TD,Sharma JM.Isolation and differentiation of chicken mesenchymal stem cells from bone marrow[J].Stem Cells,2009,18(10):1485-1492.
[7]Hung SC,Chen NJ,Hsieh SL,etal.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bonemarrow[J].Stem Cells,2002,20(3):249-258.
[8]Deryugina EI,Muller-Sieburg CE.Stromal cells in long term cultures to the elucidation of hematoporetic development[J].Crit Rev Immunol,1993,13(2):115-119.
[9]陳凱,康現江,張平,等.SD大鼠骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)及表型、純度鑒定[J].山東醫(yī)藥,2010,50(11):34-36.
[10]Friedenstein AJ,Petrakova KV,Kurolesova AI,et al.Heterotopic of bonemarrow.Analysisof precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues[J].Transplantation,1968,6(2):230-247.
[11]田少囡,候玲玲,關偉軍,等.北京油雞肺間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].生物技術通報,2011,12(233):139-145.
[12]高健,梁桂金,樸英姬,等.豬骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)及生物學特性[J].中國獸醫(yī)學報,2013,33(5):788-793.
[13]Colter DC,Class R,DiGirolamo CM,etal.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bonemarrow[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3213-3218.
[14]Morikawa S,Mabuchi Y,Kubota Y,et al.Prospective identification,isolation,and systemic transplantation ofmultipotentmesenchymal stem cells in murine bonemarrow[J].JExp Med,2009,206(11):2483-2496.
[15]Hennrick KT,Keeton AG,Nanua S,et al.Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype[J].Am JRespir Crit Care Med,2007,175(11):1158-1164.
[16]Strem BM,Hicok KC,Zhu M,et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Keio J Med,2007,54 (3):132-141.