葛夫軍

(山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院，山東臨沂276000)

胃癌的浸潤(rùn)與侵襲是多因子、多通路共同作用與調(diào)控的結(jié)果，細(xì)胞外基質(zhì)浸潤(rùn)和基底膜破壞則為其重要原因之一?；|(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)能夠特異性降解與破壞細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的重要成分Ⅳ型膠原，是參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要介導(dǎo)因子［1］;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1 (TIMP-1)是一種分布廣泛的內(nèi)源性MMP抑制劑，可抑制 MMP蛋白水解作用［2］。本研究通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)胃癌、癌旁胃黏膜組織及胃潰瘍組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)，探討兩者與胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2009年10月～2012年10月于山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院普外科行胃癌手術(shù)的患者43例(胃癌組)，男24例，女19例;年齡29～72歲，中位年齡53歲。術(shù)中同時(shí)留取胃癌組織43份及距腫瘤邊界＞5 cm的癌旁組織35份。均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，其中腫瘤直徑＜5 cm者29例、≥5 cm者14例;按照2011版NCCN胃癌臨床實(shí)踐指南［3］高中分化15例、低分化28例，浸潤(rùn)深度在T1～T3級(jí)22例、T4級(jí)21例，臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期18例、Ⅲ期25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。設(shè)同期手術(shù)的8例胃潰瘍穿孔患者為對(duì)照組，男5例，女3例;年齡27～68歲，中位年齡51歲。以上病例全部排除冠心病、高血壓、糖尿病、結(jié)核、腦血管病及其他腫瘤病史，并排除半年內(nèi)有手術(shù)史者;兩組性別、年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。兩組胃黏膜標(biāo)本取出后一部分浸泡于RNAstore保存液(北京天根生化科技有限公司)中，另一部分置于液氮中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的檢測(cè)方法

1.2.1 組織總RNA提取和cDNA合成 總RNA提取試劑盒和Quant cDNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自天根生化科技公司。RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其透過(guò)率與純度采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。以O(shè)ligo-dT15為引物，參照20μL反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈。以上所有步驟均嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 PCR反應(yīng) 根據(jù)NCBI GenBank中人源cDNA序列，內(nèi)參β-actin及MMP-9、TIMP-1引物序列由金斯瑞科技公司合成并提供。其中β-actin上游引物為5'-GGGACGACATGGAGAAAATC-3'，下游引物為5'-GATCTGGGTCATCTTCTCGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為131 bp;MMP-9正義鏈為5'-CCTTCTACGGCCACTACTGT-3'，反 義 鏈 為 5'-TCCACCTGGTTCAACTCACT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為575 bp;TIMP-1正義鏈為5'-ACTTCCACAGGTCCCACAAC-3'，反義鏈為5'-AGAAAGATGGGAGTGGGAAC-3'，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物405 bp。PCR反應(yīng)條件:變性94℃ 1 min，退火55℃1 min，延伸72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán);72℃5 min。紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，采用Kodak DC 290凝膠成像系統(tǒng)分析。各組βactin和MMP-9、TIMP-1的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的凈像素值及目的基因的相對(duì)表達(dá)水平采用Kodak1D1圖像分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較用方差分析法，兩兩比較用最小顯著差異LSD法;相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用直線相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胃黏膜組織中 MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達(dá) 三種胃黏膜組織中MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA的瓊脂糖凝膠電泳均出現(xiàn)長(zhǎng)約為575 bp和405 bp的條帶，明亮度以胃癌組織中T4級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期者為著(見(jiàn)圖1);兩指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

2.2 MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達(dá)均與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)(P均＞0.05)，與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.3 胃癌組織中MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 在胃癌T4級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期組織中MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，P均＜0.05(r分別為-0.32、-0.51、-0.48)。

圖1 MMP-9 m RNA、TIMP-1 m RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 三種胃黏膜組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 m RNA的表達(dá)比較(±s)

表1 三種胃黏膜組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 m RNA的表達(dá)比較(±s)

注:與其他兩種組織比較，*P＜0.05

胃黏膜組織MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA胃癌組織 0.901 7±0.108 2* 0.487 6±0.071 1*癌旁組織 0.765 9±0.119 6 0.365 9±0.085 2胃潰瘍組織0.748 5±0.104 2 0.328 5±0.067 1

表2 MMP-9 m RNA和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(±s)

表2 MMP-9 m RNA和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(±s)

臨床病理特征 n MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA分化程度高中分化 15 0.772 0±0.138 6 0.356 8±0.081 9低分化 28 0.787 6±0.100 2 0.392 5±0.093 3腫瘤直徑(cm)＜5 29 0.769 0±0.092 9 0.370 3±0.089 3≥5 14 0.776 2±0.110 3 0.379 9±0.072 0浸潤(rùn)深度T1～T3級(jí) 22 0.780 1±0.112 8 0.381 8±0.078 1 T4級(jí) 21 0.954 3±0.097 9 0.518 6±0.060 4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)13 0.773 5±0.094 7 0.377 2±0.087 6有30 0.948 2±0.110 6 0.527 6±0.089 2臨床分期Ⅰ+Ⅱ期 18 0.778 4±0.134 6 0.386 0±0.071 3Ⅲ期25 0.965 3±0.106 1 0.540 2±0.073 3

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌復(fù)發(fā)患者中腹膜轉(zhuǎn)移占60%，是胃癌治療的難點(diǎn)［4］;發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，5年生存率接近0［5］。分子生物學(xué)研究［1］發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲涉及多基因、多步驟，而腫瘤細(xì)胞發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移的重要先決條件之一就是其細(xì)胞外基質(zhì)降解和基底膜破壞。MMP是一類Zn2+依賴性蛋白酶家族，主要由結(jié)締組織分泌，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的類型已超過(guò)20種。MMP-9為MMP超家族的重要成員，因能特異性降解和破壞Ⅳ型膠原在腫瘤浸潤(rùn)、侵襲中發(fā)揮重要作用［1］。此外，MMP-2降解后的Ⅰ型膠原能夠激活MMP-9，后者可再與MMP-13協(xié)同降解與破壞其他基底膜成分。

已有多項(xiàng)研究［1，6，7］表明，MMP及其抑制劑TIMP在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用。TIMP在腫瘤及其間質(zhì)組織中均有表達(dá)，被認(rèn)為是MMP的天然抑制劑。TIMP主要在酶原活化及活化MMP階段調(diào)控 MMP的表達(dá)與活性。TIMP-1與MMP-9酶原所形成的穩(wěn)定復(fù)合物能夠阻止后者的自我活化;而TIMP-1與活化MMP-9結(jié)合能夠直接抑制后者的催化活性［8～10］。Mroczko等［11］和Zhang等［12］研究均發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中可檢測(cè)到TIMP-1表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。本研究顯示，胃癌組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)均顯著高于癌旁組織和胃潰瘍組織，尤以T4級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期者為著;MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)均與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)，與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。表明MMP-9及TIMP-1在胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與多篇文獻(xiàn)［8，11，12］報(bào)道類似。本研究還顯示，在胃癌 T4級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期組織中MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明MMP-9與TIMP-1之間存在著平衡與制約。MMP-9低表達(dá)、TIMP-1高表達(dá)時(shí)，MMP-9活性受到抑制，TIMP-1發(fā)揮主導(dǎo)作用，保護(hù)基底膜的完整，促使腫瘤局限; MMP-9高表達(dá)、TIMP-1低表達(dá)時(shí)，MMP-9降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的脫落、轉(zhuǎn)移。研究［13，14］認(rèn)為，TIMP-1和MMP-9之間的動(dòng)態(tài)平衡在影響腫瘤浸潤(rùn)與侵襲過(guò)程中更有意義，兩者比例失衡較其中某一單獨(dú)因素的改變更為重要。MMP和TIMP在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡被打破，TIMP較MMP表達(dá)降低或活性降低時(shí)，TIMP對(duì)MMP的抑制能力相對(duì)減弱，導(dǎo)致MMP活性增強(qiáng)，促使細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解與破壞，為腫瘤細(xì)胞突破基底膜提供條件，甚至造成淋巴或血行轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達(dá)升高，且與腫瘤浸潤(rùn)、侵襲有關(guān)。

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