姚慶完，何友華

(1昆山市疾病預(yù)防控制中心，江蘇昆山215301;2昆山市中醫(yī)醫(yī)院)

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的常見病原菌，其耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣，且對亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率也逐年上升［1］，給臨床抗感染治療帶來困難。為了解本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥情況及機(jī)制，本研究對70株耐亞胺培南的鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)進(jìn)行了耐藥表型和碳青霉烯酶耐藥基因分析，旨在為臨床防治此類細(xì)菌感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株來源:收集2010年1月～2012年12月自昆山市中醫(yī)醫(yī)院門診及住院患者分離的CRAB共70株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離到的相同細(xì)菌;菌株主要來源于痰標(biāo)本、血液及尿液。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為本市疾病預(yù)防控制中心微生物室長期保存菌株。②儀器與試劑:Mueller Hinton(MH)培養(yǎng)基購自廣州迪景微生物科技有限公司，抗菌藥物紙片購自O(shè)xiod公司(英國);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，分析純)購自Sigma公司，配制成0.5 mol/L水溶液后以NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0、高壓滅菌，4℃冷藏備用;S1000梯度PCR儀、Powerpac Basic基礎(chǔ)電泳儀、GelDoc System全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品，DNA Marker為美國Thermo公司產(chǎn)品，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物公司。

1.2 藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法。分別檢測分離菌株對13種常用抗菌藥物的敏感性。①在平板上挑取適量已分離菌落、溶于無菌生理鹽水中，用比濁儀將菌液濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，含菌?1～2)×108cfu/L;用無菌棉簽浸入調(diào)節(jié)好的細(xì)菌懸液(多余細(xì)菌懸液在管壁擠出)，在平板上反復(fù)涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平皿60°，最后沿平板周圍涂2圈，保證涂布均勻;平板在室溫下干燥5 min后貼紙片，使紙片完全與瓊脂表明接觸，各紙片中心相距＞24 mm、紙片距平板內(nèi)緣＞15 mm，15 min后將貼有紙片的平板置于35℃孵育24 h。結(jié)果判讀:用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑(以mm為單位)，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)按敏感、中度敏感、耐藥三種結(jié)果報(bào)告。

1.3 分離菌株金屬酶表型檢測 將70株CRAB接種在MH瓊脂平皿上，35℃溫箱孵16～18 h;挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水稀釋菌液濃度至1×105cfu/mL，用棉拭子均勻涂抹菌液于MH平板上;在每個(gè)平板的正中貼上2張亞胺培南紙片，紙片之間的距離為4～5 cm，在其中一張亞胺培南紙片上滴加EDTA(37.5 μg/μL)20μL，將每個(gè)MH平板放入35℃溫箱孵育過夜，觀察結(jié)果。結(jié)果判定:對同一菌株，滴加EDTA后抑菌圈直徑增大≥7 mm為金屬酶表型陽性［2］。

1.4 分離菌株碳青霉烯酶表型檢測 采用改良Hodge試驗(yàn)。按照文獻(xiàn)［3］將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922稀釋10倍后涂布于MH平板，中間貼亞胺培南(10μg)紙片，用接種環(huán)挑取受試菌自紙片外緣向平板邊緣劃線接種。35℃孵育過夜后判定結(jié)果:亞胺培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長者為陽性，即受試菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.5 分離菌株碳青霉烯酶基因型分析 ①PCR引物設(shè)計(jì):參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)針對 OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1及VIM-1的引物，由上海生工合成(全部引物序列略)。②菌株復(fù)蘇:用2μL取菌環(huán)挑取菌液接種于MH瓊脂糖平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選典型單菌落轉(zhuǎn)種于MH肉湯，置于37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱(轉(zhuǎn)速180)，過夜培養(yǎng)14～16 h。③DNA模板制備:取200μL菌液放入1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清;每管加入100μL滅菌水，打勻，100℃水煮10 min;12 000 r/min高速離心5 min，上清即為模板DNA(煮沸法)，取上清置于1.5 mL管中，-80℃凍存?zhèn)溆?。④PCR擴(kuò)增和DNA序列分析:PCR反應(yīng)體系為25μL，包括上下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，DNA模板2.0μL，無菌水8.5μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(8 V/cm)共60 min，用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)獲取電泳圖像。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 70株CRAB對13種常用抗菌藥物的敏感性見表1。

表1 70株CRAB對13種抗菌藥物的敏感性(%)

2.2 分離菌株金屬酶表型及碳青霉烯酶表型 70株CRAB中金屬酶表型陽性10株，碳青霉烯酶表型陽性68株。

2.3 分離菌株碳青霉烯酶基因型 70株CRAB中基因型檢出率OXA-51為100%(70/70)、OXA-23為94.29%(66/70)、IMP-1為11.43%(8/70)，所有菌株均未檢出OXA-24、OXA-58及VIM型基因。部分電泳圖見圖1、2。任意挑選2株OXA-23陽性株的擴(kuò)增片段序列與 GenBank中注冊號為CP003846.1的鮑曼不動(dòng)桿菌BJAB07104全基因中1999403～1999865的463個(gè)核苷酸序列99%一致;任選1株IMP陽性株的擴(kuò)增片段序列與GenBank中注冊號為CP003846.1的鮑曼不動(dòng)桿菌BJAB0710 4全基因中1764839～1765576的738個(gè)核苷酸序列99%一致。

圖1 OXA-23型碳青霉烯酶電泳圖

圖2 IMP型碳青霉烯酶電泳圖

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床常見的條件致病菌，廣泛存在于自然界，生存力極強(qiáng)，具有耐干燥、不易被消毒劑滅活等生物特點(diǎn)，在不發(fā)酵糖類菌中的構(gòu)成比占不動(dòng)桿菌屬中第一位［5］。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性尤其是多重藥物耐藥性給抗感染治療帶來巨大困難，并成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一［6］。鮑曼不動(dòng)桿菌所致醫(yī)院感染日益增多，其已成為主要的醫(yī)院感染病原菌，且多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。

本研究顯示，CRAB對臨床常用抗菌藥物的耐藥率均較高，且多重耐藥嚴(yán)重。鮑曼不動(dòng)桿菌強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力及快速獲得耐藥性的能力，使其感染極易造成流行，需引起有關(guān)部門的高度重視［7］。本研究中CRAB對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率明顯低于哌拉西林/他唑巴坦，原因可能是舒巴坦對鮑曼不動(dòng)桿菌具有天然抗菌活性(對細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白有抑制和殺滅作用)，頭孢哌酮的抗菌活性可被舒巴坦增強(qiáng);對阿米卡星敏感性較高可能與臨床用藥選擇有關(guān)，因該藥為濃度依賴性靜止期殺菌劑，單獨(dú)使用效果不佳。CRAB可同時(shí)對多種抗菌藥物(包括氨基糖苷類和氟喹諾酮類)耐藥，目前用于治療其感染的藥物極為有限。臨床藥師對抗菌藥物的應(yīng)用指導(dǎo)將有助于延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［8］;積極治療基礎(chǔ)疾病，提高患者自身免疫力、減少侵入性操作、嚴(yán)格控制抗菌藥物的使用種類和時(shí)間，是防止耐藥菌株產(chǎn)生的關(guān)鍵。

鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性有地區(qū)性差異，根據(jù)菌株來源和分布地區(qū)的不同，碳青霉烯酶的種類也存在差異。鮑曼不動(dòng)桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因之一是產(chǎn)生了碳青霉烯水解酶，與鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)的碳青霉烯水解酶包括B類金屬β-內(nèi)酰胺酶和D類OXA型酶，其中D類OXA型酶在該菌對亞胺培南耐藥中的作用更為重要。本研究顯示，70株CRAB全部檢出OXA-51型基因，此與OXA-51基因只存在于鮑曼不動(dòng)桿菌中，且可作為鮑曼不動(dòng)桿菌檢測標(biāo)志物的國內(nèi)外報(bào)道［9］一致。文獻(xiàn)［10］報(bào)道，產(chǎn)生OXA-23型碳青霉烯酶可能是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的主要原因。本實(shí)驗(yàn)共66株檢出OXA-23型基因，檢出率與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道［11］一致。提示OXA-23型基因在本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物中起重要作用。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)檢出攜帶金屬酶IMP-1菌株8株，提示在本地區(qū)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制中金屬酶亦有參與。本研究中用EDTA增強(qiáng)試驗(yàn)檢測金屬酶表型及改良Hodge試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶表型的結(jié)果與PCR結(jié)果存在一定差異，可能有以下幾個(gè)原因:①紙片法中EDTA本身可抑制細(xì)菌生長而導(dǎo)致抑菌圈擴(kuò)大;②本研究只檢測IMP、VIM型基因，其他基因型的金屬酶或非特異性引起改良Hodge試驗(yàn)出現(xiàn)假陽性［12］。③blaOXA-23基因的表達(dá)依賴于基因上游的插入序列ISAba1提供的強(qiáng)啟動(dòng)子，ISAba1缺失使得酶基因無法表達(dá)出具有生物活性的酶［13］。

總之，本地區(qū)CRAB耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物;OXA-51、OXA-23及金屬酶基因IMP-1在介導(dǎo)本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥中起重要作用。

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