王賽, 周李, 康蓮蓮, 楊榮, 劉群

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

抗病毒中藥復(fù)方制劑對雛雞IFN-γ水平影響的研究

王賽, 周李, 康蓮蓮, 楊榮, 劉群

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

為了探討抗病毒中藥復(fù)方制劑的抗病毒作用機(jī)理和為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù), 采用水萃取法制備抗病毒中藥復(fù)方浸膏制劑, 將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為陰性對照組、陽性對照組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組, 在免疫接種NDV-Lasota株滅活疫苗的基礎(chǔ)之上, 以IFN-γ(干擾素γ)為檢測指標(biāo), 研究中藥復(fù)方制劑對雛雞血清IFN-γ水平的影響. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抗病毒中藥復(fù)方制劑具有誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)雛雞在免疫應(yīng)答過程中IFN-γ產(chǎn)生的作用, 誘導(dǎo)作用可能與中藥劑量及機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān).

抗病毒中藥復(fù)方制劑; 雛雞; IFN-γ(干擾素γ)

本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下, 根據(jù)病毒性疾病的治療原則, 以“祛邪”藥白花蛇舌草、金銀花和“扶正”藥黃芪、甘草等組成抗病毒中藥復(fù)方制劑, 在獸醫(yī)臨床上針對自然發(fā)病的雞新城疫(ND)、雞傳染性法氏囊病(IBD)、鴨病毒性肝炎(DH)、禽流感(AI, H9)、禽腫頭綜合征等疾病的治療取得良好效果的基礎(chǔ)之上(劉群等, 2011), 為了探討其抗病毒作用機(jī)理和擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍, 在14日齡雛雞接種NDV-Lasota株滅活疫苗的基礎(chǔ)之上, 連續(xù)給予不同劑量的該中藥復(fù)方制劑, 觀察其對雛雞血清IFN-γ水平的影響,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下.

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

NDV油乳劑滅活疫苗, 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物藥品有限公司提供(NDV-Lasota株, 批號:2012001, 生產(chǎn)日期:20120101).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

14日齡青腳麻羽雛雞, 由成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院提供.

1.1.3 受試藥物

抗病毒中藥復(fù)方制劑由白花蛇舌草、金銀花、黃芪、甘草等中藥組成. 中藥飲片購于四川省成都市北京同仁堂, 由四川省獸藥監(jiān)察所鑒定.

1.1.4 主要試劑和儀器

雞IFN-γELISA試劑盒(北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司, 201202); 超速離心機(jī)(德國, Eppendorf); Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國, BioTek)等.

1.2 方法

1.2.1 抗病毒中藥復(fù)方制劑的制備

將中藥飲片混合, 參照《中藥復(fù)方總化學(xué)成分(浸膏)提取工藝研究》(江平康等, 2011)制備中藥復(fù)方浸膏：浸泡0.5小時、12倍加水量、煎煮3次、煎煮時間1小時, 水提浸膏收率為57.8%, 換算成生藥含量并分別制成

2g/ml、1g/ml、0.5g/ml濃度的口服液, 4℃冰箱保存.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

14日齡青腳麻羽雛雞150只, 隨機(jī)分成5組, 每組30只. 各組處理如下：

陰性對照組：按0.5ml/只頸部皮下注射滅菌生理鹽水, 常規(guī)飼喂.

陽性對照組：按0.5ml/只頸部皮下注射NDV油乳劑滅活疫苗, 常規(guī)飼喂.

高劑量中藥組：按0.5ml/只頸部皮下注射NDV油乳劑滅活疫苗, 同時按4g(生藥)/kg(體重)/天拌料口服中藥復(fù)方口服液, 連續(xù)服用5天.

中劑量中藥組：按0.5ml/只頸部皮下注射NDV油乳劑滅活疫苗, 同時按2g(生藥)/kg(體重)/天拌料口服中藥復(fù)方口服液, 連續(xù)服用5天.

低劑量中藥組：按0.5ml/只頸部皮下注射NDV油乳劑滅活疫苗, 同時按1g(生藥)/kg(體重)/天拌料口服中藥復(fù)方口服液, 連續(xù)服用5天.

1.2.3 IFN-γ含量的測定

實(shí)驗(yàn)動物在分組處理前隨機(jī)抽取5只雛雞, 翅靜脈采血1.5ml; 疫苗接種及處理后的第7、14、21、28d, 即21、28、35、42日齡, 每組隨機(jī)抽取5只雛雞, 翅靜脈采血1.5ml, 待血液室溫自然凝固10～20min后, 2000～3000rpm離心20min, 收集血清, 供IFN-γ的測定.

按照雞IFN-γELISA試劑盒操作規(guī)程測定雛雞血清IFN-γ的含量.

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以折線圖、均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示, 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對各組按不同檢測點(diǎn)進(jìn)行組內(nèi)和組間比較分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 雞IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果

雞IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果見表1, 圖1

表1 雞IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品吸光值(450nm)Table 1 Absorbance of Chicken IFN-γ standard product(450nm)

圖1 雞干擾素γ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Chicken IFN-γ standard curve

標(biāo)準(zhǔn)曲線是以標(biāo)準(zhǔn)品濃度由低到高、從左至右作為橫坐標(biāo)X軸, 450nm下讀取的各檢測孔O.D值作為縱坐標(biāo)Y軸, 在Logit-Log直線回歸模式下繪制的曲線. 該實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9639, 已達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求(＞0.92)水平, 表明標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可用.

2.2 各組實(shí)驗(yàn)動物組內(nèi)IFN-γ水平的變化情況

各組實(shí)驗(yàn)動物組內(nèi)IFN-γ水平的動態(tài)變化情況見表2

表2 各組實(shí)驗(yàn)動物組內(nèi)IFN-γ水平的動態(tài)變化值(ng/L,±S, n﹦5)Table 2 Dynamic change value of IFN-γ in each group(ng/L ,±S, n﹦5)

表2 各組實(shí)驗(yàn)動物組內(nèi)IFN-γ水平的動態(tài)變化值(ng/L,±S, n﹦5)Table 2 Dynamic change value of IFN-γ in each group(ng/L ,±S, n﹦5)

注：同行右肩有相同小寫字母的數(shù)據(jù)表示無顯著差異, P＞0.05; 無相同小寫字母有相同大寫字母的數(shù)據(jù)表示有顯著差異, P0＜.05; 完全無相同字母的數(shù)據(jù)表示有極顯著差異, P＜0.01.Note：The dates with different lowercases within a row means significant difference(P＜0.05); and without the same lowercase but with the same uppercases mean no significant difference(P＞0.05); Completely without the same letter means most significant difference(P＜0.01).

分組日齡14 21 28 35 42陰性對照組 20.9874±1.5487aA24.4131±1.2259bB40.1352±0.4868dD29.8797±2.0611cC27.5567±2.0047cC陽性對照組 20.9874±1.5487aA26.3543±1.6450bB46.4017±5.2315dD31.8123±1.4057cC29.4534±1.1000bcBC高劑量中藥組 20.9874±1.5487aA24.4868±0.7527aA50.0835±3.5838dD30.3891±4.3265bB37.7183±3.2267cC中劑量中藥組 20.9874±1.5487aA24.4500±1.0304bB44.0628±1.0181dD27.7289±1.8439cC27.6773±1.9194cC低劑量中藥組 20.9874±1.5487aA26.2549±0.7086bB46.9905±3.2642dC28.0362±5.0479cB30.9365±1.0523cB

表2表明：除高劑量中藥組外, 其它各組在免疫接種后第7d, 血清IFN-γ含量開始上升, 并在免疫接種后14d達(dá)到最大值, 與實(shí)驗(yàn)前比較差異極顯著(P＜0.01), 之后雖略有下降, 但仍高于實(shí)驗(yàn)前(P＜0.01)水平; 高劑量中藥組在免疫接種后第7d, 血清IFN-γ含量雖有所上升, 但差異不顯著(P＞0.05), 同樣在疫苗接種后的14d達(dá)到最大值, 之后略有下降, 但仍高于實(shí)驗(yàn)前, 差異極顯著(P＜0.01). 實(shí)驗(yàn)表明：各組動物血清IFN-γ含量變化規(guī)律相似, 均在免疫接種后14d達(dá)到高峰, 之后略有下降, 但都高于實(shí)驗(yàn)前水平; 高劑量中藥組雖然可能具有延緩機(jī)體IFN-γ產(chǎn)生的作用, 但具有使血清IFN-γ含量維持在一個較高的水平上的作用.

2.3 各組實(shí)驗(yàn)動物組間IFN-γ水平的變化情況

各組實(shí)驗(yàn)動物組間IFN-γ水平的動態(tài)變化情況見表3

表3 各組實(shí)驗(yàn)動物組間IFN-γ水平的動態(tài)變化值(ng/L,±S, n﹦5)Table 3 Dynamic change value of IFN-γ with each group(ng/L ,±S, n﹦5)

表3 各組實(shí)驗(yàn)動物組間IFN-γ水平的動態(tài)變化值(ng/L,±S, n﹦5)Table 3 Dynamic change value of IFN-γ with each group(ng/L ,±S, n﹦5)

注：同行右肩有相同小寫字母的數(shù)據(jù)表示無顯著差異, P＞0.05; 無相同小寫字母有相同大寫字母的數(shù)據(jù)表示有顯著差異, P0＜.05; 完全無相同字母的數(shù)據(jù)表示有極顯著差異, P＜0.01.Note：The dates with different lowercases within a row means significant difference(P＜0.05); and without the same lowercase but with the same uppercases mean no significant difference(P＞0.05); Completely without the same letter means most significant difference(P＜0.01).

分組日齡21 28 35 42陰性對照組 24.4131±1.2259a40.1352±0.4868aA29.8797±2.0611 27.5567±2.0047aA陽性對照組 26.3543±1.6450b46.4017±5.2315bcB31.8123±1.4057 29.4534±1.1000abA高劑量中藥組 24.4868±0.7527a50.0835±3.5838cB30.3891±4.3265 37.7183±3.2267cB中劑量中藥組 24.4500±1.0304a44.0628±1.0181abAB27.7289±1.8439 27.6773±1.9194aA低劑量中藥組 26.2549±0.7086b46.9905±3.2642bcB28.0362±5.0479 30.9365±1.0523bA

表3表明：免疫接種后第7d, 陽性對照組和低劑量中藥組血清IFN-γ含量顯著高于其它各組(P＜0.05); 免疫接種后第14d, 除中劑量中藥組外, 其它各組IFN-γ均高于陰性對照組, 差異極顯著(P＜0.01), 同時高劑量中藥組IFN-γ顯著高于低劑量中藥組和陽性對照組(P＜0.05); 免疫接種后第21d, 所有各組之間IFN-γ差異不顯著

(P＞0.05); 免疫接種后第28d, 高劑量中藥組IFN-γ高于其它各組, 差異極顯著(P＜0.01), 陰性對照組、陽性對照組、中劑量中藥組之間沒有顯著差異(P＞0.05), 低劑量中藥組IFN-γ高于陰性對照組和中劑量中藥組(P＜0.05),但與陽性對照組無顯著差異. 實(shí)驗(yàn)表明：高劑量中藥組在連續(xù)給藥5d后, 具有誘導(dǎo)機(jī)體IFN-γ產(chǎn)生的作用, 在免疫接種后的14d達(dá)到最高峰, 均高于其它中藥組和陽性對照組, 之后雖略有下降, 但仍然高于其它中藥組和陽性對照組(P＜0.05).

綜合以上分析, 結(jié)合各組實(shí)驗(yàn)動物IFN-γ水平變化折線圖2, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：高劑量中藥組在連續(xù)給藥5d后, 能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)雛雞在接種新城疫滅活疫苗后7-14d的血清IFN-γ水平升高, 免疫14d后達(dá)到最高的50.0835ng／L, 以后雖有所下降, 但在免疫接種后的28d(37.7183ng／L)仍然高于(P＜0.05)陽性對照組(29.4534 ng／L)和中劑量中藥組(27.6773 ng／L)及低劑量中藥組(30.9365 ng／L )的IFN-γ水平. 表明抗病毒中藥復(fù)方制劑具有誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)雛雞在免疫應(yīng)答過程中IFN-γ產(chǎn)生的作用, 誘導(dǎo)作用可能與中藥劑量有關(guān).

圖2 各組實(shí)驗(yàn)動物雞IFN-γ水平的動態(tài)變化折線圖Fig. 2 The line graph of dynamic Change of Chicken IFN-γ with each group

3 討論與結(jié)論

本研究采用純化的雞IFN-γ抗原包被微孔板制成固相抗原, 依次與IFN-γ和與HRP標(biāo)記的雞IFN-γ抗原結(jié)合, 形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物, 加底物TMB顯色, 顏色的深淺與樣本中IFN-γ呈正相關(guān), 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中IFN-γ的濃度(ng／L). 在生理情況下由于IFN基因處于被抑制的靜止?fàn)顟B(tài), 細(xì)胞不會自發(fā)產(chǎn)生, 但是在病毒、植物血凝素等有絲分裂原或特異性抗原誘發(fā)劑存在的情況下, 能擺脫抑制而獲得表達(dá); IFN-γ是由活化的Th1、CD8＋CTL、NK細(xì)胞產(chǎn)生, 具有活化巨噬細(xì)胞、促進(jìn)APC(S)表達(dá)MHC－Ⅱ類分子表達(dá)以提高抗原遞呈功能、促進(jìn)MHC－Ⅰ類分子表達(dá)以增強(qiáng)CTL細(xì)胞的殺傷活性、增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性、促進(jìn)B細(xì)胞分化增殖、抑制TH2細(xì)胞分化及細(xì)胞因子合成等, 是目前機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用最快的第一病毒防御體系.

有研究表明(段亮亮, 劉群, 江平康等, 2010)：以白花蛇舌草、金銀花、黃芪、甘草等組成的抗病毒中藥復(fù)方制劑在雞胚內(nèi)和成纖維細(xì)胞上具有抗雞新城疫病毒的作用和增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和兔IFN-γ產(chǎn)生的作用. 對雛雞血清IFN-γ含量的實(shí)驗(yàn)研究表明：高劑量中藥組(4g/kg/d)在連續(xù)給藥5d后, 能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)雛雞在接種新城疫滅活疫苗后7-14d的血清IFN-γ水平升高, 免疫14d后達(dá)到最高的50.0835ng／L, 之后雖有所下降, 但在免疫接種后的28d仍然高于(P＜0.05)陽性對照組(29.4534 ng／L)和中劑量中藥組(27.6773 ng／L)及低劑量中藥組(30.9365 ng／L )的IFN-γ水平, 表明中藥復(fù)方制劑具有誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)雛雞在免疫應(yīng)答過程中IFN-γ產(chǎn)生的作用, 從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力, 誘導(dǎo)作用可能與中藥劑量及機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān). IFN-γ不僅具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能, 而且能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞合成抗病毒蛋白以降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成、組裝和釋放, 從而中斷病毒感染、限制病毒擴(kuò)散, 體現(xiàn)了中獸醫(yī)“扶正可以祛邪”、“祛邪可以扶正”、“扶正祛邪兼施”的治療原則, 為擴(kuò)

大該中藥復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用范圍和探討中藥抗病毒作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

[1] 劉群, 朱子鳳, 周李, 等. 中藥復(fù)方對家禽病毒性疾病的治療效果[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(6): 3630-3632.

[2] 江平康, 劉群, 楊松沛, 等. 中藥復(fù)方總化學(xué)成分(浸膏)提取工藝研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(7): 242-245.

[3] 段亮亮, 劉群, 江平康. 中藥復(fù)方在雞胚水平上抗雞新城疫病毒的作用研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(4): 192-194.

[4] 劉群, 段亮亮, 江平康. 中藥復(fù)方抗雞新城疫病毒作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(20): 10697-10699, 10724.

[5] 江平康, 劉群, 周李. 中藥復(fù)方“病毒克”對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 37(5): 761-764.

[6] 江平康, 謝嘉賓, 劉群, 等. 抗病毒中藥復(fù)方對兔HCLV模型IFN-γ影響的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2012, 11(21): 118-120.

Research on the effect of the Chinese antiviral herbal compound on IFN-γ level of the chicks

WANG Sai, ZHOU Li, LIU Qun, KANG Lian-lian, YANG Rong
(School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

This study is to discuss the mechanism of antiviral effect of the Chinese herbal compound, which would provide some

for its safe and logical clinical medication. The water extraction method is adopted to produce Chinese herbal compound extractum, and different doses of extractum are mixed with fodder to feed the chicks. All the experimental animals are divided into five groups: positive control group, low dose group, midst dose group, high dose group, and negative control group. After they are immunized with inactivated vaccine of NDV-Lasota, IFN-γ is taken as the testing index to study the effect of the Chinese herbal compound on the chicken serous IFN-γ. The results show that Chinese herbal compound could induce the production of INF-γ in the progress of the immune response, while this effect could be closely related to drug dosage and immune state.

Chinese antiviral herbal compound; chick; INF-γ

S853

A

1003-4271(2014)01-0027-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.06

2013-09-21

劉群(1965-), 男, 博士, 副教授; Email：liuqun2567@qq.com.

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD34B02-4); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研建設(shè)平臺(11NPT03)