馬超 馮世慶 班德翔 劉洋 高仕杰

膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量眾多的一大類細(xì)胞群體，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的90%以上，而星形膠質(zhì)細(xì)胞是其中最主要的組成成分之一，在調(diào)控神經(jīng)元微環(huán)境、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞遷移、維持神經(jīng)組織形態(tài)、提供神經(jīng)營養(yǎng)因子及輔助完善突觸聯(lián)系等方面均發(fā)揮著重要功能[1]。體外培養(yǎng)是研究星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、功能及神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥物學(xué)的重要手段，但以往的取材以大腦皮質(zhì)為主，脊髓相對(duì)較少[2-4]。本研究參照國內(nèi)外培養(yǎng)分離星形膠質(zhì)細(xì)胞的方法，擬建立脊髓源性星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、純化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1～2 d的SD大鼠，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），200目濾網(wǎng)、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗，EDTA-0.25%胰酶，D-Hank’s液（北京索萊寶公司），兔抗大鼠膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體，TRITC標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（武漢博士德生物有限公司），倒置相差顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）[2]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脊髓組織星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 新生1～2 d的SD大鼠腹腔麻醉后，用75%酒精浸泡消毒5～10 min，眼科剪沿大鼠后背正中剪開，眼科彎鑷輕輕鈍性分離脊柱兩旁組織，顯露視野，然后在超凈臺(tái)上取脊髓組織，放入D-Hank’s液漂洗3次后剪碎，置于0.25%的EDTA-胰蛋白酶中并用吹管輕輕吹打15～20次，37 ℃消化10 min。立即用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化[3-4]。再次用吸管輕輕吹打15～20次制成細(xì)胞懸液，以200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，1300 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吸管吹打重懸，制成的細(xì)胞懸液接種于已包被左旋多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min進(jìn)行差速黏附處理[5]。取出培養(yǎng)瓶，輕輕翻轉(zhuǎn)，吸取細(xì)胞懸液，倒置相差顯微鏡下臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按1×106/mL接種于另一已包被左旋多聚賴氨酸培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d，次日37 ℃恒溫?fù)u床280～300 r/min水平振蕩16～18 h后，倒掉培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基漂洗2次后，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3～4 d換液，直到細(xì)胞即將鋪滿瓶底融合，進(jìn)行消化傳代[6]。

1.2.2 脊髓組織星形膠質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的細(xì)胞即將融合鋪滿瓶底時(shí)，吸去舊培養(yǎng)基，用D-Hank’s液洗滌2次，加入適量0.25%的EDTA-胰蛋白酶，以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)，消化8～10 min，待細(xì)胞回縮變圓并約有30%～50%懸浮在消化液時(shí)，立即用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，然后用吸管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底部，使細(xì)胞從瓶壁上脫落。然后將細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，1300 r/min離心5 min，棄上清液，加入少量含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，倒置相差顯微鏡下臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按2×104/mL密度接種在預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d或細(xì)胞鋪滿瓶底將要融合時(shí)再進(jìn)行傳代。

1.2.3 脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)瓶每日置于倒置相差顯微鏡下，觀察細(xì)胞胞體、突起形態(tài)及生長情況。將每次傳代的少量細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于放入事先用左旋多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)2 d后，吸去6孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS漂洗5 min×3次；加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS漂洗5 min×3 min，行GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)顯色。兔抗GFAP多克隆抗體（1：50）4 ℃冰箱過夜。第2天復(fù)溫20 min，PBS漂洗5 min×3次，避光，加TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1：100），37 ℃孵育1 h。DAPI復(fù)染5 min，PBS漂洗5 min×3次，熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)結(jié)果 剛接種的細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察，呈圓形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中；24 h后大部分細(xì)胞已貼壁，但表面仍有少許細(xì)胞漂?。唤?jīng)16～18 h的恒溫?fù)u床振蕩，換液后溶液中無漂浮細(xì)胞，貼壁部分細(xì)胞伸出細(xì)小突起；培養(yǎng)3～4 d后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，長出突起的細(xì)胞明顯增多比例越來越大，而神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞所占比例越來越少。一般培養(yǎng)8～10 d細(xì)胞即將鋪滿瓶底融合成片。

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)結(jié)果 所培養(yǎng)的細(xì)胞即將鋪滿瓶底達(dá)到完全融合時(shí)，進(jìn)行第1次傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞生長活躍，12 h即可貼壁，3～5 d細(xì)胞就可鋪滿瓶底。倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，突起較多較長，細(xì)胞核多位于胞體的一側(cè)，以橢圓形較為常見；胞漿豐富，密度較低，核/漿比較小。

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中的骨架蛋白，為其特異性標(biāo)志蛋白[7]。培養(yǎng)的細(xì)胞每次傳代應(yīng)用兔抗GFAP多克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，陽性細(xì)胞胞體為紅色熒光。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示第3次傳代陽性率分別達(dá)到95%以上，絕大多數(shù)細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3 討論

體外細(xì)胞培養(yǎng)是醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的一種重要方法，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分子及藥物學(xué)研究。獲得較純的星形膠質(zhì)細(xì)胞是進(jìn)行其功能及其相關(guān)研究的基礎(chǔ)[8]。目前，有關(guān)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)資料較少。筆者通過參照國內(nèi)外星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，并加以改良，獲得脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞傳至第3代時(shí)純度達(dá)到95%以上，完全符合實(shí)驗(yàn)要求，為損傷、缺氧及藥物等因素對(duì)脊髓組織星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究提供了基本的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

此星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法的特點(diǎn)：（1）使用新生1～2 dSD大鼠，一方面是因?yàn)樵缙诎l(fā)育過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖發(fā)生在胚胎晚期和出生后[9]；另一方面，新生大鼠神經(jīng)元不再分裂，并且在體外不易存活，經(jīng)傳代后可有效去除神經(jīng)元。（2）無須在顯微鏡下操作，減少細(xì)胞污染率，手術(shù)技巧要求簡單。（3）濾網(wǎng)的使用，可以有效地去除被膜等組織，有利于獲得單細(xì)胞懸液。（4）體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中，成纖維細(xì)胞較其他細(xì)胞更易黏附，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞貼壁速度存在明顯差異，故采用差速黏附處理，去除培養(yǎng)基中的成纖維細(xì)胞成分。（5）由于星形膠質(zhì)細(xì)胞在底層生長，且其黏附能力較強(qiáng)，其他膠質(zhì)細(xì)胞在其上層生長，經(jīng)原代和傳代經(jīng)恒溫?fù)u床震蕩，盡可能去除了小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等不易貼壁的雜細(xì)胞[10-11]。（6）用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶，更有利于細(xì)胞貼壁。但實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意：（1）每次胰酶消化傳代時(shí)，要在倒置相差顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)，把握好消化程度，既不消化過度，又不消化不完全，待細(xì)胞變圓并約30%～50%細(xì)胞懸浮在消化液時(shí)，立即用含胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化。避免消化過度而影響細(xì)胞活力。（2）用吸管吹打時(shí)要徹底，但動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免氣泡的產(chǎn)生，否則，產(chǎn)生的氣泡表面張力損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致死細(xì)胞增多。（3）每次換液及傳代前應(yīng)盡量搖晃培養(yǎng)瓶，并用D-Hank’s液洗培養(yǎng)瓶，可進(jìn)一步去除貼壁較慢的其他細(xì)胞。（4）每天顯微鏡下對(duì)細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察，同時(shí)注意培養(yǎng)基顏色的改變。

綜上所述，通過此方法本實(shí)驗(yàn)獲得的脊髓源性星形膠質(zhì)細(xì)胞純度能夠滿足符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，有利于探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓神經(jīng)組織的生物學(xué)功能，為脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)疾病及因素的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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